Роль элементов цитоскелета в регуляции Ca2+-сигналов в перитонеальных макрофагах

• Автор: Курилова, Лидия Сергеевна
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 156 с. : ил.

Оглавление

Список сокращений

1. Введение

2.Обзор литературы

2.1. Механизмы Са2 сигнализации в клетках.

2.1.1. Механизмы мобилизации Са2 из внутриклеточных депо.

2.1.1.1. Фосфоннозитидный путь передачи сигнала.

2.1.1.2. Структура 1Р3рецептора

2.1.1.3. Механизмы регуляции 1Р3рецептора

2.1.1.4.Биофизические характеристики 1Р3чувствительных каналов Са2выброса.

2.1.2. Механизмы входа Са2 в ii

2.1.2.1. Депозависимый вход Са2 в клетки
2.1.2.2. Модели депозависимого входа Са
2.1.2.2.1. Модели с участием водорастворимых вторичных посредников.
2.1.2.2.2.Модель конформационного связывания
i i .
2.1.2.2.3. Модели, предполагающие встраивание в плазматическую мембрану мембранных везикул, содержащих дспозависимые Са2каналы
2.1.2.2.4. Модель связывания по типу секреции ii i .
2.1.2.3. Биофизические характеристики дспозависимых Са2каналов
2.1.2.4. Молекулярная природа депозависимых Са2каналов
2.1.2.5. Функциональная роль депозависимого входа Са
2.1.2.6. Возможная роль депозависимого входа Са2 в различных патологических процессах.
2.2. Элементы цитоскслета.
2.2.1. Актиновые филаменты.
2.2.2. Микротрубочки.
2.2.3. Роль структур цитоскслета в процессах внутриклеточной сигнализации
2.2.4. Цитоскелет в макрофагах.
2.3. Заключение по обзору литературы и постановка задачи исследования.
3. Материалы и методы исследования.
3.1. Объект исследования
3.2. Растворы.
3.3. Установка для измерения внутриклеточной концентрации Са2 с
помощью флуоресцентного Са2зонда Бига2АМ
4.Результаты и обсуждение
4.1. Влияние агентов, вызывающих реорганизацию элементов цитоскелета,
на Са2сигналы в макрофагах.
4.1.1. Влияние агентов, модифицирующих структуру цитоскелета, на Са сигналы, вызванные ингибиторами эндоплазматичских Са2АТФаз.
4.1.2. Влияние агентов, вызывающих модификацию элементов цитоскелета, на
Са сигналы, индуцированные пуринергическими агонистами.
4.1.3. Влияние латрункулииа В на Са2сигналы в макрофагах.
4.1.4. Влияние стабилизатора актиновых филаментов джасплакинолида на Са2сигналы в макрофагах.
4.1.5. Влияние стабилизатора микротрубочек таксола на Са сигналы,
вызванные пуринергическими агонистами или ингибиторами эндоплазматических Са2ДТФаз
4.2. Влияние ингибиторов фосфоинозитидкиназ на Са2 сигналы в макрофагах.
4.3. Влияние ингибитора везикулярного транспорта брсфсльдина Л на Са2 сигналы в макрофагах.
5. Общее заключение
6. Выводы.
7. Список литературы.

Список сокращений
2 внутриклеточная концентрация Са
белки белки малой молекулярной массы семейства iii
Са2транспортарующий белок.
I i ix фактор входа
диацилглицерин
2,5дитретбутил 1,4бензогидрохинон
I i iv i ионный ток, текущий через депозависимые Са2каналы Са2ток, активируемый опустошением депо
I инозитолмонофосфат
1Р2 инозитол1,4дифосфат
1Р3 инозитол1,4,5трифосфат
1Рзрсцептор рецептор к инозитол1,4,5трифосфату 1Рз чувствительный канал Са2выброса
1Р4 инозитол1,3,4,5тетракифосфат
i i i белки, ассоциированные с микротрубочками
iii центры сборки микротрубочек
I2 фосфатидилинозитол4,5дифосфат
бслок канал белок, кодируемый геном i i
АДФ аденозинднфосфат АМФ аденозинмонофосфат
АТФ аденозинтрифосфат
АЦ аденнлатциклаза
ГДФ гуанозиндифосфат
ГТФ гуанозинтрифосфат
ЖК жирные кислоты
сгасканалы i iv Са2 Са2каналы, активируемые при опустошении депо
СР саркоплазмагнческий рстикулум
ТГ тапсигаргин
ФЛС фосфолипаза С
ЦПК циклопьязониковая кислота ЭР эндоплазматическии ретикулум.

1. Введение
Актуальность


К настоящему времени разработано несколько поколений высоко чувствительных флуоресцентных Са2зондов, позволяющих измерять концентрацию Са2 в цитозоле и во внутриклеточных оргаиеллах ii . Као, i . ЭР, митохондрии 2 быть хслатирован, т. Свободный кальций находится в равновесии с хелатированным кальцием. Именно свободный или ионизированный Са2 регулирует различные внутриклеточные процессы. Са2 является универсальным вторичным мессенджером, действующим в клетках бактерий, растений и животных. Са , приводит к гибели клеток i . Са не может подвергаться метаболическим превращениям, как другие посредники, поэтому Са должна жестко регулироваться. В связи с этим, в клетках в процессе эволюции возникла сложная система белков, связывающих Са2, и транспортных систем, выводящих Са2 из клетки. Чтобы избежать создания высокой Са , опасной для клеток, концентрация свободного Са2 в покоящихся клетках поддерживается на очень низком уровне 0 нМ, т. Са2 в наружной среде. Другим следствием жесткой регуляции 2 является то, что Са2 диффундирует очень медленно и на малые расстояния в цитоплазме. Установлено, что ион Са2т диффундирует на расстояние
0,,5 мкМ до взаимодействия с Са связывающим белком i . Чтобы обойти двойную проблему цитотоксичности высоких 2 и низкой диффузии Са2 в цитоплазме, клетки выработали простой механизм сигнализации, основанный на генерации коротких импульсов 2 Са2спайков i, , а i, а, . Активация многих мембранных рецепторов приводит к двухфазному увеличению Са2ь вследствие мобилизации Са2 из внутриклеточных депо и входа Са2 но градиенту концентрации из наружной среды. Все клетки млекопитающих, за исключением эритроцитов, содержат органеллы, способные аккумулировать Са2 против электрохимического градиента. При соответствующих условиях Са2 выходит из этих депо медленно из митохондрии, секреторных гранул или быстро из саркоплазматического ретикулума СР мышечных клеток, Са2 депо немышечных клеток. Са2запасающие органеллы, способные к быстрому обмену кальцием с цитоплазмой, содержат Са2буферные системы и Са2каналы, по которым Са2 освобождается из депо. Са2дспо немышечных клеток. В немышечных клетках кальциевые депо отличаются большой сложностью и разнообразием . Инозитол1,4,5трисфосфат 1Р3 освобождает Са2 из нсмитохондриалыюго пула, сходного с ЭР . Ivi, i, . Р3 в среднем 1Р3 освобождает примерно Са2, запасенного в немитохондриальном пуле, а остальная часть Са2 мобилизуется при действии Са2 ионофоров i, Ivi, . Многие немышечные клетки содержат Са2депо, не чувствительные к 1Р3, но, как и СР мышц, чувствительные к рианодину и кофеину Всгi, Ivi, . В последнее время сложилось представление о том, что ключевую роль в генерации и проведении Са2сигналов в невозбудимых клетках играют такие внутриклеточные органеллы, как ЭР, ядро, митохондрии . Для измерения концентрации Са2 во внутриклеточных депо используются флуоресцентный Сазонд 2 и Са2чувствительный белок экворин i, , v . Основным 1Рзчувствитсльным Са2депо является ЭР или его специализированный субкомпартмент кальциосома. ЭР способен накапливать большие концентрации Са2, затем быстро освобождать Са2 в цитозоль. Общая концентрация Са2 в ЭР составляет мМ . Большая часть Са2 в ЭР связана с кальрстнкулином и другими Са2связывающимн белками. Концентрация свободного Са2 в полости ЭР различных типов клеток в состоянии покоя составляет мкМ . Прямое измерение концентрации Са2 в ЭР позволило оценить скорости выхода Са2 из депо и восполнение ионами Са2 ЭР Ваггего . Инкубация клеток I в бескальциевой среде способствует быстрому уменьшению концентрации Са2 в ЭР течение 3 мин при С или в течение мин при С. Ингибирование Са2АТФы уменьшает время опустошения депо до мин Ваггего . Полное восполнение ЭР после добавления Са2 в наружную среду происходит в различных типах клеток за 2 мин при С и за мин при С Ваггего . Кальциевые деио в немышечных клетках содержат Са2ЛГФазу, сходную, но не идентичную АТФазе в саркоплазматичсском ретикулуме. Са2АТФаза в немышечных клетках является продуктом гена 3 . Ii, . Кроме того, предполагают, что 1Р3чувствителыюс депо может аккумулировать Са1 путем совместной работы Са2АТФазы и 2НСа2обмешшка i .