Исследование механизмов влияния Na/K-АТФазы на регуляцию экспрессии генов и развитие клеточной смерти

• Автор: Пшежецкий, Дмитрий Валерьевич
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 133 с. : ил.

1.1. АТФаза молекулярная структура, механизм функционирования и регуляция

1.1.1. Основные кинетические характеристики НаКА ТФазы.

1.1.2. Состав и изоформы АТФозы

1.1.3. СтруктураАТФазы. сайты связывания ионов и АТФ.

1.1.5. Регуляция НаКАТФазы

1.1.5. Ингибиторы КаКАТФазы.

1.1.6. Эндогенные уабаинподобные соединения и их роль в патогенезе гипертонической болезни

. АТФаза как универсальный регулятор трансмембранного градиента натрия и калия

1.2.1. Генерация мембранного потенциала.

1.2.2. Системы транспорта, сопряженные с переносом Аа и

1.2.3. Регуляция объема клеток

1.3. АТФаза И ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ СИП 1АЛИЗАЦИЯ
1.3.1. Гены, экспрессия которых регулируется активностью НаК АТФазы.
1.3.2. Сигнальные каскады, запускаемые ингибированием НаКАТФазы.
1.4. Роль АТФазы в развитии клеточной смерти.
1.4.1. Лпоптоз и некроз два вида клеточной смерти.
1.4.2. Ингибирование ЛТФазы как фактор защиты клеток от апотоза
1.4.3. Уабаин как инициатор клеточной смерти
1.5. ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ СЛЕДУЮЩИЕ ИЗ ОБЗОРА ЛИТЕРАТУРЫ
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Культура клеток
2.1.1. Клетки гладких мышц сосу дов V v .
2.1.2. Клетки гладких мышц, трансфицированные А аденовирусом Е1А V
2.1.3. Эпителиальные клетки С7 и СП
2.1.4. Эндотелиальные клетки сосудов РАЕС.
2.2. МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОЦЕНКИ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ КЛЕТОК .
2.2.1. Фазовоконтрастная микроскопия.
2.2.2. Сохранение связи клеток с подложкой
2.2.3. Окраска клеток трипановым синим
2.3. Биохимические критерии оценки жизнеспособности клеток
2.3.1. Деградация МТТ.
2.4. Морфологические и биохимические критерии апоптоза и некроза
2.4.2. Определение клеточного объема
2.4.3. Определение количества фрагментированного хроматина
2.4.4. Определение содержания низкомолекулярных фрагментов ДНК
2.4.5. Активность каспазы3.
2.5.МОТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ ионного гомеостаза клеток.
2.5.1. Определение активности Кнасоса.
2.5.2. Определение содержания обмениваемого калия и натрия
2.5.3. Определение свободного и обмениваемого внутриклеточного кальция
2.5.4. Измерение внутриклеточного
2.6. МОЛЕКУЛЯР1ЮБИОЛОП1ЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.6.1. Определение общей и меченойНтимидином ДНК
2.6.2. Определение экспрессии белков .
2.6.3. Определение экспрессии РНК Ног
2.6.4. Измерение синтеза РНК и белка
2.7. РЕАКТИВЫ.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Ингибирование АТФазы уасаииом защищает клетки гладких мышц от апоптоза, ВЫЗВАННОГО РАДИОАКТИВНЫМ МЕЧЕНИЕМ ДНК.
3.1.1. Ингибирование клеточного роста Нтимидином протекает через его включение в ДНК.
3.1.2. Сравнительный анализ эффекта I тимидина на рост V, эпителиальных и эндотелиальных клеток
3.1.3. Влияние С тимидина на синтез ДНК
3.1.4. Обработка клеток Нтимидино.и вызывает их смерть
3.1.5. Внедрение СНтимидина в ДНК клеток вызывает их апоптоз
3.2. МЕХАНИЗМ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ РАННЕГО ОТВЕТА В УБМС СОСУДОВ, ВЫЗВАННЫЙ ИНГИБИРОВАНИЕМ ЛФЗЫ
3.2. . Ингибирование НаКАТФазы вызывает резкое увеличение экспрессии сКов.
3.2.2. Уабаин вызывает экспрессию сРов через увеличение соотношения НаК,
3.2.3. Вызванная уабаином экспрессия сРоз проходит через увеличение На,.
3.2.4. Роль клеточного объема, внутриклеточного и Со2 в инициированной уабаином экспрессии сРоз
3.3. ПОИСКИ НАЧАЛЬНОГО СИГНАЛА, ПРИВОДЯЩЕГО К ГИБЕЛИ КЛЕТОК ЭПИТЕЛИЯ ПОЧЕЧНЫХ КАНАЛЬЦЕВ ПРИ ДЕЙСТВИИ УАБАИНОМ
3.3.1. Маркеры смерти С7МОСК клеток при действии уабаина.
3.3.2. Роль НаКАТФазы и внутриклеточных концентраций калия и натрия.
3.3.3. Роль кальция.
3.3.4. Роль макромалекулярного синтеза в смерти эпителиальных клеток, инициированной уабаиномЯ
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
4.1. Ингибирование уабаином лФлзы в УБМС подавляет апогпоз, вызванный РАДИОАКТИВНЫМ МЕЧЕНИЕМ ДНК
4.2. Экспрессия генов раннего ответа в УБМС сосудов, запускаемая уабаином доказательства НОВОГО Ыл,ОПОСРЕДОВАННОГО Слг,НЕЗАВИСИМОГО механизма сопряжения возбуждения и ТРАНСКРИПЦИИ.
4.3. Некроз в клетках эпителия почечных канальцев, обработанных уабаином, не связан с ингибированием ионных потоков, опосредованных ЫаКАТФазой
3 А КЛ ЮЧ ЕНИ Е .
ВЫ ВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


АТФаза принадлежит к широко распространенному классу АТФаз Ртипа, которые отвечают за активный транспорт Н, , 2, К, Са2, 2, 2 через клеточные мембраны как у про, так и у эукариот К, , . Все эти ферменты используют энергию гидролиза АТФ для транспорта катионов против их электрохимических градиентов. Во время каталитического акта, осуществляемого этими ферментами, происходит фосфорилирование остатка аспарагиновой кислоты, что является уникальным свойством АТФаз этого типа Варфоломеев С. Д., . АТФазы типа связывают, переносят и высвобождают ионы, находясь при этом попеременно в двух катионзависимых конформациях и Е2 К, , . О распространенности и роли АТФазы в жизни клеток и организма в целом говорит тот факт, что всего цитоплазматического АТФ в покоящемся организме человека идет на поддержание работы этого фермента. В клетках нервной системы эта цифра может доходить до . В зависимости от типа клеток на их поверхности может находится до 6 молекул АТФазы, распределенных с равными промежутками или собранных в кластеры, как, например, на базолатеральной мембране поляризованных эпителиальных клеток. В некоторых типах клеток могут также существовать внутриклеточные запасы фермента, высвобождаемые при гормональной стимуляции i , . При опытах с АТФазой в гомогенатах клеток невозможно обнаружить направленный ионный транспорт, а только уабаинзависимый гидролиз АТФ Скулачсв В. П., . Эксперименты же с вывернутыми и правильно ориентированными везикулами мембран эритроцитов и с ферментом, реконструированным в липосомы, показали, что АТФаза не только активируется натрием изнутри, а калием снаружи, но и имеет участки транслокации этих катионов. Рис. Ряд катионов может заменять калий, связываясь и активируя АТФазу, при этом сродство фермента к ним падает в ряду 4i. В присутствии одного натрия на обеих вне и внутриклеточной сторонах фермента активность АТФазы составляет только около 5 от оптимальной , см. Единственным катионом, способным конкурировать с натрием за связывание с АТФазой внутри клетки, является литий, при этом его сродство к ферменту приблизительно в 5 раз ниже. При и К 0 шМ, то есть концентрациях, характерных для интактной клетки, активность АТФазы составляет только от максимума см. К 4 шМ около . Скорость работы фермента при насыщающих концентрациях лигандов составляет при С около 4 циклов в минуту. В очищенных фракциях АТФазы также был идентифицирован третий белок, названный усубъсдиницей. Он представляет из себя небольшой гидрофобный полипептид с массой 8 , который долгое время считался примесью, пока не было доказано, гто он является компонентом ЛТФазы . Недавно было обнаружено, что подобно субъединице, усубъединица может менять зависимость активации асубъединицы калием i Р . Эти данные однако нуждаются в дальнейшей экспериментальной проверке. Многие ферменты экспрессируются в виде многочисленных молекулярных форм, и для описания этого феномена Маркерт и Моллер предложили термин изозимы , . АТФаза не составляет исключения и, как многие важнейшие белки, экспрессируется в клетке в виде нескольких изозимов , v , . Первоначально доказательства существования нескольких изозимов ЛТФазы были получены при изучении кривых ингибирования фермента уабаином, которые показали существование изоформ с различным сродством к ингибитору , . К настоящему времени у позвоночных идентифицированы четыре асубъсдиницы а1, а2, аЗ и а4 i , . V , , а третья рЗ у млекопитающих и амфибии i . Экспрессия а и изоформ АТФазы тканеспецифична, АТФаза присутствует почти во всех тканях и является основным изозимом в почках М, , в то время как содержание а2 и аЗ изоформ в почках составляет не более 0,1 от количества субъединицы i К . З в нервной системе. Р2изозим обнаружен в скелетных мышцах, железах и нервных тканях, в то время как РЗ экспрессируется в сетчатке, легких и печени , . Экспрессия АТФазы регулируется рядом гормонов и изменяется в процессе онтогенеза и при ряде патологических состояний . Функциональное значение изозимов АТФазы остается недостаточно изученным.