Адаптивная роль ДНКазы II в сперматозоидах вьюнов (Misgurnus fossilis L.)

• Автор: Нечаевский, Юрий Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 145 с.

ВВЕДЕНИЕ

Цель исследования и постановка задачи

Новизна полученных данных и научнопрактическое значение работы

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ДНКаза II в ядрах клеток и ее биологическая роль.

1.1. Ядерная фракция ДНКазы II

1.1.1. Распределение ДНКазы II в клетках тканях животных .

1.1.1.1. ДНКаза II в активно пролиферирующих

тканях

1.1.1.2. ДНКаза II в неделящихся терминально дифференцированных клетках

1.1.1.3. ДНКаза II в генеративных органах и клетках

1.1.2. Субклеточная локализация ДНКазы II

1.2. Функция ядсрной фракции ДНКазы II
1.2.1. Характеристические свойства ДНКазы II
1.2.2. Корреляция активности ДНКазы II с фазой клеточного цикла
1.2.3. ДНКаза II в программированной клеточной
гибели апоптозе
1.2.3.1. Клетки яичников китайского хомячка
1.2.3.2. Миелоидные клетки человека
1.2.4. ДНКаза II в дифференциации
специализированных клеток,
функционирующих В безъядерном СОСТОЯНИИ
I.3. Заключение
ЧАСТЬ II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
ИССЛЕДОВАНИЯ
II. 1. Характеристика вьюнов в качестве объекта
исследования
II. 1.1. Систематическое положение вьюнов,
распространением размножение их в природе
II. 1.2. Содержание вьюнов в лабораторных условиях, созревание мужских половых продуктов их строение и структура хроматина
II. 1.2.1. Строение спермиев рыб и сперматогенез
II. 1.2.2. Нуклеосомоподобная структура хроматина
сперматозоидов
.2. Реагенты и определения
.3. Животные, выделение сперматозоидов и
анализ клеточной фракции
.3.1. Анализ степени дифференциации и гомогенности клеточной фракции
.3.2. Анализ интактности клеток в образцах
.4. Определение внутриклеточного
.5. Воздействия
.6. Стимуляция созревания ооцитов i viv,
осеменение и оплодотворение
.7. Анализ суперспиральной плотности ДНК сперматозоидов
.8. Приготовление экстрактов клеток
.9. Определение ДНКазной активности
Очистка ДНКазы сперматозоидов
Ферментативная характеристика ДНКазы
Другие методы
ЧАСТЬ III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ
ОБСУЖДЕНИЕ
III. 1. Суперсниральная структура ДНК
сперматозоидов выонов
III. 1.1. Анализ клеточной фракции
III. 1.2. ДНК в сперматозоидах вьюнов
суперспирализована
III.2. Влияние физических и физиологических
факторов на суперспиральную структуру ДНК сперматозоидов вьюнов
1.2.1. Физиологическое сезонное изменение структуры ДНК сперматозоидов
1.2.2. Температура окружающей среды среды содержания рыб
1.2.3. Рентгеновское облучение головы или туловища
1.2.4. Внутриклеточный сперматозоидов
1.2.5. уОблучение сперматозоидов i vi
1.3. Развитие икры от интактных самок, оплодотворенной сперматозоидами вьюнов, подвергнутых облучению или температурному стрессу функциональный тест
1.4. ДНКаза II фермент, релакснрующий ДНК в спсрмиях вьюнов
1.4.1. Идентификация ДНКазной активности
1.4.2. Очистка ДНКазы II
1.4.3. Свойства очищенного фермента Ю
III.4.4 Обсуждение ДНКазаП ЮЗ
1.5. Исследование биологической роли ДНКазы II сперматозоидов вьюнов Ю
1.5.1. Температурный стресс или облучение головы рыб вызывает субклеточное перераспределение активности ДНКазы II в сперматозоидах Ю
1.5.2. Исследование i vi функциональной активации
ДНКазы
1.6. Общее обсуждение
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ ш
ЛИТЕРАТУРА


Такими факторами в условиях эксперимента являются, в частности, быстрое изменение температуры среды содержания температурный стресс и ионизирующее излучение. Известно, что в результате стресса происходит повреждение ДНК соматических клеток позвоночных животных i . Однако состояние ДНК сперматозоидов в процессе стрессреакции практически не изучено, хотя мужские гаметы могут представлять подходящую модель для исследования влияний факторов внешней среды, потому что они являются i viv объектом воздействий, приводящих к критическим последствиям в развитии организма. Целью настоящей работы явилось исследование процесса нормальной и патологической деградации ДНК сперматозоидов вьюна при действии физических и физиологических факторов. Логика исследований, предпринятых для достижения поставленной цели, неизбежно привела к поиску и последующей идентификации фермента метаболизма ДНК ДНКазы II в этих терминально дифференцированных клетках и изучению его функциональной роли. Выявление суперспиральной конформации ДНК сперматозоидов вьюнов. Исследование влияния на структуру ДНК этих клеток физических температурный стресс иили опосредованное и непосредственное действие ионизирующей радиации факторов среды, а также длительного лабораторного содержания рыб. Изучение развития икры, оплодотворенной спсрмиями рыб, подвергнутых облучению или температурному стрессу. Идентификация ДНКазной активности в сперматозоидах вьюнов. Выделение и очистка ДНКазы II и изучение ее свойств. Исследование функциональной роли фермента в спермиях в системе адаптивных реакций. Впервые в сперматозоидах обнаружено существование суперспиральной конформации ДНК, что предполагает готовность макромолекулы к последующей экспресии генома в составе зиготы и к энзиматической деградации непосредственно в клетке отрицательная суперспирализация ДНК, создавая топологическое напряжение в макромолекуле, способствует образованию одноцепочечных участков, которые являются сайтами энзиматического действия. Впервые в сперматозоидах обнаружен фермент метаболизма ДНК ДНКаза II. Такой факт позволяет предполагать, что негативная селекция репродуктивных клеток у рыб может происходить непосредственно на уровне зрелых половых клеток. Впервые обнаружено, что влияние физических и физиологических факторов приводит к релаксации сверхспиральных витков ДНК спермиев. Эти результаты интерпретируются, как доказательство того, что конформация ДНК в сперматозоидах регулируется i viv. Изменения третичной структуры ДНК под действием факторов среды коррелировали с многочисленными нарушениями развития икры, оплодотворенной сперматозоидами выонов, подвергнутых этим воздействиям. Полученные данные указывали на важное функциональное значение для спермиев влияния изучаемых условий внешней среды. ДНКазы II среди хроматиновых субфракций сперматозоидов с увеличением связывания ее хроматином и внутриклеточное закисление до величины , достаточной для инициации кислой ДНКазы i vi. Полученные факты позволяют полагать, что, вопервых, ДНКаза II участвует в представленной здесь термо и радиоиндуцированной релаксации суперспиральной ДНК сперматозоидов и, вовторых, функционирование ДНКазы II в этих клетках связано с нормальной сезонная элиминация сперматозоидов, оставшихся в семенниках после нереста или патологической, индуцированной внешними повреждающими воздействиями, деградацией ДНК. В результате диссертационного исследования разработана новая модельная клеточная система, представленная сперматозоидами вьюнов приоритетные характеристики модели суперспиральная конформация ДНК и наличие ДНКазы II, позволяющая изучать i viv и i vi роль компактной упаковки генома в физиологической регуляции на этапе передачи генетической информации в последующих поколениях животных. Использование здесь этой системы позволило изучить влияние физических и физиологических факторов на ДНК и охарактеризовать функциональную роль ДНКазы II в зрелых мужских гаметах. Разработанная модельная клеточная система может иметь исключительное значение для исследования механизма программированной гибели мужских половых клеток.