Молекулярные механизмы действия моторных белков мышечных и немышечных клеток

• Автор: Кулева, Надежда Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.02, 03.00.04
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 199 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение

Обзор литературы

1. Взаимосвязь структуры и функции моторных белков

1.1. Структура моторных доменов

1.2. Взаимосвязь структуры и функции моторного домена миозина

1.3. Передача сигнала от активного центра к участку связывания субстрата движения

2. Роль гидролиза АТФ в осуществлении элементарного двигательного акта

2.1. Механизмы гидролиза АТФ миозином, динеином и кинезином

2.2. Активный центр миозиновой АТФазы

2.3. Изменение структуры активного центра в ходе гидролиза АТФ .

2.4. Химические исследования катализа гидролиза АТФ
2.4.1. Специфические фоточувствительные метки активного
центра .
2.4.2. Собственная флуоресценция миозина .
2.4.3. Реактивные цистеиновые остатки
2.4.4. Реактивные остатки лизина .
2.4.5. Посттрансляционная модификация
2.4.6. Протеолитическое расщепление
3. Структура и функции актина .
3.1. Структура мономера и актиновой нити .
3.2. Ковалентная модификация актина
3.3. Взаимодействие с моторным доменом миозина .
3.4. Применение поляризационной микрофлуорометрии для исследования динамики структуры Фактина при взаимодействии с миозином
Методы исследования .
1.Методы получения ферментных препаратов для сравнительного
исследования 0обмена .
2.Методы получения субфрагмснта 1 миозина скелетных мышц кролика
3.Методы блокирования реактивных аминокислотных остатков миозина скелетных мышц кролика .
4. Методы исследования реакций изотопного обмена .
5. Методы регистрации изменений параметров поляризованной флуоресценции Ф актина в составе теневых мышечных волокон .
5.1. Получение моделей теневых мышечных волокон .
5.2. Связывание с актином теневого волокна миозина, субфрагмснта
и его производных
5.3. Измерение параметров поляризации флуоресценции .
5.4. Применение математической модели для анализа данных поляризованной флуоресценции .
6. Методы регистрации изменения свойств актина при неэнзиматическом гликозилировании .
Результаты и их обсуждение 8.
1. Сравнительное исследование интермедиатов гидролиза АТФ
различными АТФазами по данным Ообмена .
1.1. Сравнение 0обменных реакций, катализируемых миозиновой
и динеиновой АТФазами
1.2. 0обмен в отсутствие нуклеотида, катализируемый АТФазой натурального актомиозина
1.2.1. Сравнение изотопного обмена кислорода в системе натурального актомиозина и мембран саркоплазматического ретикулума .
1.2.2. Идентификация поданным 0обмена АТФазной
активности плазматических мембран синаптосом .
1.3. Применение Ообмена для сравнения активных центров миозинов различного происхождения по данным 0обмена
1.3.1. Миозин скелетных мышц цыпленка .
1.3.2. Миозин гладких мышц и тимоцитов теленка .
2. Исследование влияния ковалентной модификации реактивных аминокислотных остатков миозина на интермедиаты АТФазной
реакции по данным Ообмена
2.1. Тринитрофенилирование остатков лизина
2.2. Блокирование цистеиновых остатков
2.3. Паранитрофенилирование миозина .
3. Сравнительное исследование изменений структуры актиновой нити на стадии прочного связывания с моторным доменом миозина
по данным поляризационной микрофлуорометрии
3.1. Влияние модификации моторного домена посредством ограниченного протеолиза на АТФазную активность .
3.2. Влияние связывания С1 и его производных на параметры поляризованной флуоресценции актина, меченного родаминфаллоидином
3.3. Влияние связывания С1 и его производных на параметры поляризованной флуоресценции актина, меченного
1,5 1АЕОА .
3.4. Влияние ограниченного протеолиза С1 на параметры поляризованной флуоресценции 1,5 1АЕОАМБ, связанного с
С1 в комплексе акгоСТ теневых мышечных волокон .
3.5. Влияние связывания гладкомышечного миозина на параметры поляризованной флуоресценции актина, меченного родаминфаллоидином .
3.6. Влияние связывания С1 скелетных мышц кролика на параметры поляризованной флуоресценции тромбоцитарного актина, меченного 1,5 IБ
3.7. Изменение функциональных свойств актина иод влиянием
ковалентной модификации при неэнзиматическом гликозилировании .
Заключение .
Выводы .
Список литературы


Материалы диссертации отражены в статьях в отечественных и международных журналах, в том числе в 6 обзррах сообщений опубликованы в сборниках тезисов. Взаимосвязь структуры и функции моторных белков. За последнее десятилетие к хорошо изученным семействам белков, преобразующим химическую энергию АТР в механическую их часто называют моторными белками миозину мышц, динеину ресничек и жгутиков, кинезину мозга добавился ряд новых. Кроме классических двухголового миозина II, скелетных, гладких и сердечной мышц, а также одноголового миозина 1 клеток, способных к амебоидному движению, теперь известны миозин 1 тканей высших животных и еще классов миозинов, отличающихся по происхождению, структуре и функции i, . Выделены также многочисленные аналоги динеина и кинезина, участвующие в транспорте органелл, митозе и мейозе , . Наконец, обнаружены моторные белки, которые подобно РНКполимеразе способны перемещаться вдоль нитей ДНК и подобно фактору элонгациии вдоль мРНК , . Показано, что молекула АТР азы может действовать подобно хорошо известному вращательному мотору бактериального жгутика, если к усубьединице химически пришить аналог жгутиканить актина i . Возможно, в одной клетке одновременно могут функционировать около молекул, связанных с актиновыми филаментами и микротрубочками, осуществляя различные типы движения. Если учесть и моторные белки, перемещающиеся вдоль нитей ДНК, и участвующие в движении рибосом по информационной РНК, а также еще не открытые моторные белки, то число молекулярных моторов в клетке приблизится к сотне. Рис. Количественное определение подвижности i vi . Схематическое изображение препарата фиксированной клетки с белком Л на поверхности. Белок А связанс участком антитела к хвостовому району миозина. Головки миозина взаимодействуют с пучками актиновых филаментов водорослей i и перемещаются в направлении, указанным стрелкой. Зарегистрировать движение, осуществляемое молекулярными моторами, позволяет методика определения подвижности i vi, впервые предложенная Спудичем в году . Первоначальное определение подвижности i vi состояло в регистрации движения покрытых миозином пластмассовых шариков вдоль поляризованных тяжей актина при добавлении ЛТФ рис. Затем было показано, что подобное движение i vi можно моделировать с очищенными белками головки С 1 молекул миозина связывали с подложкой, по которой в присутствии АТФ могли перемещаться актиновые нити. Этот подход также был модифицирован теперь актиновую нить прикрепляют к стеклянной игле, что дает возможность измерить силу, развиваемую головкой миозина. Усиленная обратной связью система оптических ножниц позволяет наблюдать перемещения порядка нм с уровнем силы до 7 , которые соответствуют взаимодействию одной молекулы миозина с одиночной актиновой нитью. Положение задерживающего луча лазера может быть быстро изменено электронной системой обратной связи, что позволяе т зафиксировать актиновую нить, сдвинутую одной молекулой миозина. Аналогичным образом можно зарегистрировать движения, осуществляемые другими клеточными моторами , . В таблице 1 приведены данные о скоростях, развиваемых миозином и другими молекулярными моторами при определении подвижности i viv и i vi. Биохимическим показателем работы молекулярного мотора является максимальная скорость активируемой микрофиламентами или микротрубочками аденозинтрифосфатазы. Она представлена в третьем столбце таблицы 1 как число циклов гидролиза АТФ, осуществляемых одним моторным доменом за одну секунду. Общим элементом структуры всех миозинов, динеинов и кинезинов является так называемый моторный домен, имеющий участки взаимодействия как с АТФ, источником энергии, обеспечивающим движение, так и с субстратом движения актином или тубулином. Аминокислотные последовательности моторного домена, также как и их механизмы взаимодействия с АТФ и субстратами движения достаточно консервативны в каждом классе белков , . Название и происхождение мотора Скорость i viv мкм. Скорость i vi мкм. Максимальная скорость гидролиза АТФ на один моторный домен в секунду в присутствии высоких концентраций АТФ и филаментов или микротрубочек.