Биосинтетическое дейтерирование и его применение к исследованию структуры и динамики макромолекул методом нейтронного рассеяния

• Автор: Щербакова, Инна Вячеславовна
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 123 с.

ВВЕДЕНИЕ.

РАЗДЕЛ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глина 1. Принципы биосинтетического дейгернрованин.

1.1 Влияние тяжелой воды на биологические объекты.

1.1.1 Влияние атомов дейтерия на биологические

макромолекулы. Водородный обмен

1.1.2 Влияние тяжелой воды на белки, клетки и ткани

1.1.3 Фармакологическое использование тяжелой воды и

дсйтсрированных компонентов

1.2 Выращивание биологических культур на дсйтсрированных

средах.
1.2.1 Выращивание биологических культур на богатых
дсйтсрированных средах.
1.2.2 Выращивание биологических культур на синтетических
дсйтсрированных средах.
1.2.3 Методы определения уровня включения дейтерия.
Глава 2. Рассеяние нейтронов и структура макромолекул.
2.1 Свойства нейтронов. Их получение, проведение и регистрация.
2.1.1 Свойства нейтронов.
2.1.2 Получение нейтронов
2.1.3 Регистрация нейтронов
2.2. Взаимодействие нейтронов с веществом
2.2.1 Упругое и неупругое рассеяние нейтронов
2.2.2 Рассеяние нейтронов одной частицей.
2.2.3 Малоугловос рассеяние нейтронов
2.2.4 Контраст в малоугловом рассеянии нейтронов.
2.3. олучение структурной информации из данных по упругому когерентному рассеянию.
2.3.1 Алгоритм получения структурной информации из данных
малоуглового рассеяния нейтронов
2.3.2 Структурные параметры.
2.3.3 Определение формы макромолекул
2.3.4 Метод сферических гармоник
2.4. Методы вариации контраста
2.4.1 Использование НгОi смесей
2.4.2 Двойное изотопическое замещение.
2.4.3 Тройное изотоническое замещение.
2.4.4 Метод триангуляции
2.4.5 Спинспиновый метод вариации контраста.
Глава 3. Рассеянно нейтронов м динамика макромолекул.
3.1. Динамика макромолекул из данных по рассеянию нейтронов
3.1.1. Методы исследования динамики макромолекул.
3.1.2. Нсупругое рассеяние нейтронов и динамика белков
3.1.3. Упругое некогерентное рассеяние нейтронов.
Динамический структурный фактор.
РАЗДЕЛ II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
Глава 4. Материалы и методы
4.1. Выращивание бактериальной массы на синтетических средах.
4.1.1. Выращивание бактериальной массы ii i
4.1.2. Выращивание бактериальной массы i Iii.
4.1.3. Выращивание бактериальной массы i .
4.2 Методы выделения и очистки рибосом.
4.2.1. Выделение рибосом ii i
4.2.2. Выделение рибосом i .
4.2.3. Выделение рибосомных субчастиц i
4.3 Определение доли включения дейтерия в разные компоненты клетки
4.3.1. Выделение рибосомных РНК и белков.
4.3.2. Определение включения 1 Сметки из нуклеотидов в
рибонуклеиновый и белковый компоненты клетки
4.3.3. Определение уровня включения дейтерия в
рибонуклеиновый и белковый компонент рибосом
4.4. Методы определения качества препаратов
4.4.1. С едиме 1гтацнонный анализ.
4.4.2. Денатурирующий электрофорез РНК
4.4.3. Двумерный электрофорез рнбосомных белков.
4.5. Измерение нейтронного рассеяния.
4.5.1 Измерение малоуглового рассеяния нейтронов.
4.5.2 Измерение упругого некогерентного рассеяния нейтронов
на спектрометре I .
Глава 5. Результаты и обсуждение.
5.1. Система для биосинтетического дсйтсрирования различных
компонентов рибосомы.
5.1.1. Разработка метода получения полностью дейтерированных
рибосом и рнбосомных субчастиц i i в препаративных количествах.
5.1.2. Разработка метода направленною включения дейтерия в
белковый компонент рибосом ii i в процессе выращивания.
5.1.3. Разработка метода направленного включения дейтерия в
рибонуклеиновый компонент рибосом ii i в процессе выращивания
5.1.4. Получение тотально дейтерированных нуклеозид
монофосфатов
5.2. Структурные исследования макромолекул методом упругого
когерентного рассеяния нейтронов
5.2.1. Исследование структуры низкого разрешения ЗОЯ рибосом ной субчастицы ТИегтш ИегторНИш в растворе методом малоуглового рассеяния с вариацией контраста.
5.3. Динамические исследования макромолекул методом упругого
нскогерентного рассеяния нейтронов
5.3.1. Упругое нскогеренгное рассеяние нейтронов рибосомами из психроф ильных, мезофильных и термофильных микроорганизмов
5.3.2. Динамическая подвижность рибонуклеинового и белкового компонентов рибосом ii i по данным упругого нскогерентного нейтронного рассеяния.
ЛИТЕРАТУРА
ВВЕДЕНИЕ


Один из вариантов этого метода, метод упругого некогерентного рассеяния нейтронов, базируется на том, что амплитуда нскогерентного рассеяния атомов водорода в раз больше, чем амплитуда когерентного и некоеретного рассеяния любых других атомов, включая дейтерий. Поскольку в биологических макромолекулах приблизительно всех атомов составляют атомы водорода, то исследование некогерентной составляющей позволяет охарактеризовать среднеквадратичное отклонение ядер атомов водорода. Как и в случае когерентного рассеяния, замена водорода на дейтерий приводит к существенному уменьшению вклада водородных атомов в рассеяние. Этог метод успешно применяется для изучения динамики белков, а нами он впервые использован для исследования динамики такого сложного макромолекулярного ансамбля, как рибосома. Целью нашей работы была демонстрация современных возможностей нейтронного рассеяния на лейтерированньгх образцах для получения информации о структуре и динамике биологических макромолекул. Разработка общего метода культивирования i i на дейтерированных средах, конечной целью которого было получение малой рибосомной субчастицы в нрепарагивных количествах для ее структурных исследований. РАЗДЕЛ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Глава 1. Влияние тяжелой воды на биологические объекты. Дейтерий был открыт в году как естественный изотоп водорода в воде, которая содержит 0. Использование тяжелой воды в качестве модератора в ядерных реакторах послужило стимулом для ее производства в больших количествах. В результате к году было призведено около ООО тонн чистой . Процедура получеиня тяжелой воды требует больших энергетических затрат, потому ее цена остается высокой, около 0 за килограмм . Несмотря на свою высокую стоимость тяжелая вода является доступной для изучения ее физических, химических и биологических свойсгв. Атомные массы большинства стабильных изотопов, широко использующихся в биологии С. М, 0, незначительно отличаются от массы преобладающих в природе изотопов 2С, 4, ,лО. Молекулярная масса дейтерия 2Н в два раза больше массы водорода. Кроме того, дейтерий единственный из изотопов, имеющий название, отличное от названия химического элемента, изотопом которого он является. Таблица 1. Температура плавления. С 3. Температура кипения. С 1. Плотность С, гмл 1. Температура максимальной плотности, С . Вязкость С, санти пуаз 1. Поверх носгнос натяжение С, дин см . Па см, I дин . Дж. Как следует из этой таблицы, ПЬО более плотная и вязкая, чем , и имеет более высокие точки плавления и кипения. Различия в других свойствах не столь выражены. Энергия водородных связей в выше, чем в , i , . Влияние дейтерия на биологические макромолекулы. Водородный обмен. Биологические макромолекулы в тяжелой воде подвергаются воздействию атомов дейтерия тяжелой воды изотопный эффект растворителя н атомов дейтерия, вошедших в состав макромолекулы за счет обмена ее атомов водорода на атомы дейтерия воды изотопный эффект атомов дейтерия макромолекулы . Изотопный эффект растворителя проявляется в том, что атомы дейтерия растворителя оказывают влияние на структуру воды и макромолекулы. Говоря об изотопном эффекте атомов дейтерия макромолекулы, обычно имеют виду связи С , поскольку атомы дейтерия связей . О и быстро обмениваются на атомы водорода в водном окружении и оценить биологический эффект такого дейтерирования без учета изотопного эффекта растворителя невозможно. Показано, что связь С на порядок прочнее связи С Н и мснсс подвержена химическому и энзиматическому разрыву . Разница в прочности связей С и С используется для доказательства того, что разрыв исследуемой С И связи является промежуточным этапом при функционирования фермента. Так. Остановимся на методе водородного обмена, который часто используется в изучении динамики и функционирования биомакромолскул. Атомы водорода в белках и нуклеиновых кислотах постоянно обмениваются с атомами водорода растворителя. Водородный обмен не вызывает существенных изменений свойств макромолекул и потому может служить источником информации об их структуре и динамике i. Скорость водородною обмена измеряется такими методами, как ЯМР и массспсктромегрия. Обмениваемые атомы водорода в белках связаны с атомами азота пептидных групп и атомами азота, кислорода и серы боковых полярных групп.