Изучение механизма активного транспорта и структуры каналов переноса ионов в Na+,K+-АТФазе с помощью электрических измерений на модельной мембране

• Автор: Ленц, Александр Александрович
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 159 с. : ил.

1.1. Структура Ма,КАТФазы

1.2 Субстраты, последовательность реакций и цикл Альберса Поста.

1.3. Структура и механизм работы Са2АТФазы.

1.3.1 Перемещение цитоплазматических доменов и структурные изменения в трансмембранном домене. .

1.3.2 Упрощенная схема работы С2АТФазы.

1.4. Центры связывания ионов в белке. .

1.4.1. Центры связывания ионов в Ыа,1САТФазе

1.4.2 Перестройка трансмембранных спиралей при конформационном переходе Е, Е2.

1.5. Электрогенность АТФазы. Диэлектрические коэффициенты

1.6. Модель электрогенного транспорта ионов ,К АТФазой.

1.7. Изучение электрогенного транспорта, осуществляемого АТФазой.

1.8. Переходные токи в модельной системе БЛМ с адсорбированными фрагментами
1.9. Изменения емкости, связанные с работой ,КАТФазы.
1 зависимость электрогенного транспорта
1 Реконструкция АТФазы
ГЛАВА 2. ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ОПИСАНИЕ ТРАНСПОРТА ИОНОВ НАТРИЯ В М,КАТФАЗЕ.
2.1. Физическая модель.
2.2. Энергетика и электростатика
2.3. Кинетические уравнения. .
2.4. Емкость и проводимость
2.5. Внеклеточный и внутриклеточный каналы
ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Составы растворов, выделение ,КАТФазы и кД фрагмента
3.2. Экспериментальная система БЛМ адсорбированные мембранные фрагменты
3.3. Экспериментальная система золотой электрод тиол адсорбированные фрагменты.
3.4 Метод поверхностного плазмонного резонанса.
3.5. Реконструкция ,К АТФазы и кД фрагментов в бислойную липидную мембрану но методу Шнндлера.
3.6. Метод компенсации внутримембранного поля с помощью второй гармоники емкостного тока
ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
4.1 Элсктрогснный транспорт в системе БЛМ МФ. Кинетика изменения емкости проводимости, связанные с работой ,КАТФазы при фотовысвобождении АТФ 1м1мм1мм1мм1м1м1ммм
4.2. Электрогенный транспорт в системе БЛМ МФ. Частотные зависимости изменения приращения емкости и проводимости .
4.2.1. Аппроксимация частотных зависимостей
4.2.2. Частотные зависимости изменения елкости и проводимости при различных концентрациях ионов натрия
4.3. Сравнение глубины внеклеточного и внутриклеточного каналов доступа.
4.4. Зависимость электрогенного транспорта ионов натрия КАТФазой от .
4.4.1. Измерение частотных зависимостей изменения емкости и проводимости при разных значениях .
4.5 Электростатическое поле в системе БЛМ с адсорбированными мембранными фрагментами с ,КАТФазой.
4.5.1. Электростатические потенциалы, возникающие при адсорбции МФ на БЛМ
4.5.2. Изменение электростатического поля вследствие переноса ионов натрия НаКАТФазой.
4.6 Электрогенный транспорт в системе золотой элсктродтиоладсорбированныс фрагменты
4.7. Реконструкция ,КАТФазы и кД фрагментов в бислойную липидную мембрану.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ЛИТЕРАТУРА
БЛАГОДАРНОСТИ
УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ
5I 5иодоацетамидофлюоресцеин
6 МР 6 меркаптоиурин
АМРРСР аденозин , метилентрифосфат
аденозин5трифосфат, РЗнитрофенилэтил эфир
диолеоилфосфатидилхолин
дифитаноилфосфатидилхолин
ММетил0глкжамин
фенилметансульфонилфлуоридом
политетрафторэтилен
1 Ы4Сульфобутилдипентиламинофенил бутадиенил пиридиний
додецилсульфат, натриевая соль тапсигаргин
ТМРР 5,,, тетраксис 4 сульфонатофенил порфипин
трисгидроксиметиламинометан АДФ аденозиндифосфорная кислота АТФ аденозинтрифосфорная кислота АЦП аналогоцифровой преобразователь БЛМ бислойная липидная мембрана ДК диэлектрический коэффициент МФ мембранный фрагмент УФ ультрафиолетовый ЦАП цифроаналоговый преобразователь ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота ЭПР эндоплазматический ретикулум
ВВЕДЕНИЕ


Согласно этой модели, около белка находится с внеклеточной стороны, а оставшаяся часть примерно поровну разделена между цитоплазматическим и трансмембранным участками. К
А
А
Рис. Модель ,АТФазы пояснения см. Выделение Ка,КАТФазы основано на различных модификациях метода Йоргенсена. КАТФазы и части мембранных липидов. После дифференциального центрифугирования получается суспензия незамкнутых мембранных фрагментов, содержащих высокоактивный фермент в высокой концентрации вплоть до на квадратный микрометр рис. Степень очистки превышает от общей массы белка , . Мембранные фрагменты содержат примерно 0,8 мг фосфолипидов на 1 мг белка, и 0,2 мг холестерина . Полученные таким образом препараты ,КАТФазы широко применяются в структурных и функциональных исследованиях фермента. Рис. Электронная микрофотография мембранного фрагмента, содержащего Ыа,КАТФазу ОеисЬ е а. В физиологических условиях гидролиз одной молекулы АТФ сопровождается переносом трех ионов натрия во внеклеточную среду и двух ионов калия в цитоплазму. В одной из конформаций в белке открыты сайты связывания для ионов, находящихся в цитоплазме, а в другой во внеклеточной среде. Такая модель была предложена Альберсом и Постом , . В основе лежит схема реакций переноса ионов и фосфорилирования удовлетворительно объясняющая работу фермента. Физические модели функционирования ,3i, известные в настоящее время, берут за основу биохимическую схему Альберса Поста рис. Рис. Цикл Альберса Поста и схема переноса ионов через мембрану. Левая часть схемы отражает реакции, локализованные на цитоплазматической стороне мембраны, правая на внеклеточной стороне. Символами Е1 и Е2 обозначен белок в разных конформациях. Е, АТРоЕ2Р АОР. Помимо субстратов, для работы фермента требуется присутствие ионов магния, действующих как кофактор , . Магний образует с ЛТФ комплекс, который служит субстратом в реакции фосфорилирования. В высоких концентрациях выше мМ магний обладает ингибирующим действием. В отсутствие калия фосфорилированное состояние является метастабильным, константа спонтанного дефосфорилирования при комнатной температуре составляет порядка нескольких секунд. Весь транспортный цикл обратим при соответствующих условиях. При одновременном наличии АТФ, ионов натрия и магния в цитоплазме и калия во внешней среде Ыа,КАТФаза функционирует в стационарном режиме, совершая при оптимальных концентрациях субстратов 0 0 оборотов в секунду при физиологической температуре и около оборотов при комнатной. Структура и механизм работы Са АТФазы. Значительный вклад в понимание механизма функционирования ,АТФазы могла бы внести расшифровка ее трехмерной структуры с атомным разрешением. Однако до настоящего времени получить кристаллы ,АТФазы, позволяющие выполнить рентгенографический анализ ее структуры с атомным разрешением, не удалось. Представление о строении ,АТФазы можно получить на основании структуры родственной ей
Са АТФазы, в определении которой достигнут существенный прогресс. Са2АТФаза, наряду с Ыа,КАТФазой, относится к транспортным АТФазам типа. Учитывая тот факт, что Ыа,КАТФаза имеет высокую степень гомологии с Са2АТФазой, структура и механизм функционирования Са2АТФазы позволяет сделать ряд предположений относительно возможных механизмов транспорта ионов ,АТ Фазой. ЭПР быстрых скелетных мышц
1подтип. Определены структуры шести конформаций этой Са АТФазы, в число которых входят Са2 связанное состояние 2, а также несколько Са2 несвязанных Ег, , 2, i1X и 2 i , i ii, . АТФ и ионный транспорт. Как и у Ыа,КАТФазы, Мдомен Са2АТФазы имеет трансмембранных а спиралей М1М рис. М4 и Мб частично раскручиваются при связывании ионов кальция рис. Трансмембранные участки М4М6 и М8 содержат аминокислоты, участвующие в координации ионов кальция у Са2АТФазы и натрия у ,АТФазы. Аминокислотные последовательности трансмембранных столбов М4М6, но не М8 очень консервативны для всех АТФаз Р типа. Спирали Мб значительно перемещаются во время конформационных перестроек в течение реакционного цикла, в то время как М7М сохраняют свое положение рис. Фосфорилирование происходит по 1 в Р домене.