Оптическая спектроскопия в исследовании молекулярных механизмов действия и создании новых противоопухолевых препаратов-ингибиторов ДНК топоизомеразы 1 человека

• Автор: Олейников, Владимир Александрович
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 266 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
Введение

Список сокращений

Глава 1 Современное состояние проблемы

1.1 ДНК топоизомераза I человека

1.2 Ингибиторы ДНК топоизомеразы I человека

1.2.1 Соединенияяды ДНК топоизомеразы I человека

1.2.2 Соединениясупрессоры ДНК топоизомеразы I человека

1.2.3 Гибридные ДНКрасщепляющие соединения

1.3 Методы оптической спектроскопии в исследовании

действия и ингибирования ДНК топоизомеразы I

1.4 Спектроскопия гигантского комбинационного рассеяния
1.4.1 Электромагнитный механизм усиления
1.4.2 Химические или молекулярные механизмы усиления
1.4.3 Экспериментальные методы получения спектров
гигантского комбинационного рассеяния биологических объектов
1.5 Выводы из анализа литературных данных и постановка
задач исследования
Глава 2 Новые технологии приготовления поверхностей с
регулируемыми неоднородностями. Разработка новых типов ГКРактивных поверхностей
2.1 Электромагнитные механизмы усиления КР на
поверхностных неоднородностях
2.2 ГКРактивные поверхности на основе острийных структур
2.3 Резонансы локализованных плазмонов в системе полых
металлических цилиндров
Спектры ГКР биологических молекул чувствительность и информативность метода
Заключение
Взаимодействие ДНК топоизомеразы I с ДНК методы спектроскопии КР, ГКР и КД в исследовании структурных особенностей взаимодействия
Спектры КР и ГКР ДНК топоизомеразы I человека
Спектроскопия КР и КД в исследовании комплексов ДНК топоизомеразы I с олигонуклеотидами
Спектроскопия КД и КР в исследовании тройного комплекса топоизомеразы I, олигонуклеотида и противоопухолевого ингибитора фермента
Заключение
Методы оптической спектроскопии в исследовании молекулярных механизмов действия топотекана типичного яда фермента
Ионные состояния молекулы топотекана при различных значениях раствора.
Интерпретация линий топотекана в спектрах КР. Экспериментальное отнесение линий топотекана Расчет формы нормальных колебаний топотекана Интерпретация спектральных линий топотекана
Поведение топотекана в растворе. Димеризация топотекана.
Маркеры димеризации топотекана в спекграх ГКР
Взаимодействие топотекана с ДНК. Спектроскопия линейного дихроизма в потоке комплексов ДНКтопотекан
4.6 Спектроскопия КР и ГКР в определении особенностей связывания топотекана с ДНК
4.7 Заключение
Глава 5 Молекулярные детерминанты, определяющие функции соединенийсупрессоров фермента. Производные нетропсина биснетропсины
5.1 Спектроскопия КР и ГКР комплексов биснстропсинов с ДНК
5.2 Эффективность ингибирования биснетропсинами щепления ДНК топоизомеразой I человека
5.3 Заключение
Глава 6 Конструирование соединений, сочетающих функции супрессоров и ядов ДНК топоизомеразы I человека. Конъюгат нетропсинкамптотецин структура и свойства
6.1 Конструирование гибридной молекулы камптотециннетропсин
6.2 Кинетика лактонкарбоксилатного перехода гибридной молекулы.
6.3 Влияние гибридной молекулы на каталитическую активность ДНК топоизомеразы I
6.4 Цитотоксичность гибридной молекулы в опухолевых линиях твердых раков
6.5 Вариации структуры гибридной молекулы
6.6 Анализ взаимодействия гибридных молекул с ДНК и их влияние на эффективность щепления ДНК топоизомеразой I
6.7. Заключение
Выводы
Литература


Сопоставляя полученные структурные данные, авторы i, , предложили модель механизма работы фермента. Согласно этой модели топо1 осуществляет релаксацию субстрата посредством контролируемого вращения, рис. ДНК осуществляется поэтапно и различные состояния вращения фиксируются с помощью ионных взаимодействий между ДНК, восьмой и девятой аспирапью субдомена III внутреннего домена и аспиралями линкерной области. Методы молекулярной динамики в оценке роли субдоменов в каталитическом цикле ДНК топоизомеразы I. В ходе каталитического цикла, в процессах связывания с ДНК, расщепления цепи ДНК, ее вращения и восстановления целостности i, , фермент претерпевает значительные конформационные изменения, в частности, переход от открытого несвязанного с ДНК состояния к закрытому в комплексе с ДНК. Рис. Гипотетическая модель контролируемого вращения, предложенная в i, е а 9Н. ДНК ферментом и фиксация его структуры, в и г щепление восстановление целостности ДНК, д контролируемое вращение. Определена структура только закрытого комплекса с ДНК. Одним из эффективных методов ее получения является моделирование процессов методами молекулярной динамики. Первые результаты по анализу поведения такого большого комплекса представлены в СЫИеть а а1, СЫИет, а а. В этих работах выявлена роль молекул воды в формировании водородных связей и формировании солевых мостиков установлены корреляции движений субдоменов фермента и фрагментов олигонуклеотида. Однако изза большого объема вычислительных операций для таких больших систем рассматриваются лишь малые структурные изменения комплекса. Метод постадийиого усложнения лиганда в исследовании механизмов функционирования ДНК топоизомеразы I. Для оценки вкладов отдельных специфических и неспецифических белковонуклеиновых взаимодействий разработан метод постадийиого усложнения лиганда Невинский, . Показано, что практически все нуклеотидные звенья ДНК, покрываемые ферментом, вступают с ним во взаимодействие. Высокое сродство до порядков от общего значения 7 порядков обеспечивается множеством слабых аддитивных взаимодействий Бугресв и др. В то же время относительный вклад специфических взаимодействий в общее сродство относительно мал и не превышает порядков. Основой специфичности действия фермента являются стадия ферментозависимой структурной адаптации участка ДНК к оптимальной конформации и стадия непосредственно катализа. Сопоставление скоростей структурных изменения специфических и неспецифических ДНК под действием фермента показало, что специфичность топоизомеризации определяется сгадиями реакции, на которых происходит адаптация ДНК до оптимальной конформации и сам каталитический процесс, а не стадия комплексообразования. ДНК и затем скользить до участка, содержащего специфическую последовательность. Достигнув такого участка, фермент останавливается за счет кратного повышения сродства к нему и выполняет соответствующий этап своего каталитического цикла Бугреев и Невинский, . Ингибиторы ДНК топоизомеразы I человека. Как уже было сказано, топо1 является основной клеточной мишенью многих противораковых соединений. Поэтому предметом настоящего исследования является изучение механизмов ингибирования топо1 агентами разных типов. По принципу действия ингибирующие агенты разделяются на две основные группы 1 супрессоры, то есть соединения, стерически препятствующие взаимодействию топо1 с ДНК, и 2 яды фермента соединения, фиксирующие промежуточный ДНКферментный комплекс. Супрессоры, как правило агенты, обладающие высоким сродством к ДНК и связывающиеся с ней по малой бороздке, ингибируют действие не только топоизомеразы, но и других белков, взаимодействующих с ДНК. Их применение особенно эффективно, когда концентрация топо1 в раковой клетке невелика и, наряду с воздействием на топо1, необходимо подавить действие других ферментов. Наоборот, яды топо1 специфически взаимодействуют с промежуточным ДНКферментным комплексом. Их единственной мишенью является топо1. Клеточная активность к этим ингибиторам повышается с увеличением уровня экспрессии топо1 i, .