Исследование митохондрий на уровне одиночных частиц методом флуоресцентной корреляционной спектроскопии

• Автор: Перевощикова, Ирина Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 171 с. : ил.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1.Строение и функции митохондрий в клетке роль разности электрохимических потенциалов ионов водорода

1.1.1. Строение и функции митохондрий в клетке

1.1.2. Хемиосмотическая теория Митчелла.

1.1.3. Гидрофобные катионные красители как маркеры митохондрий в клетке.

1.1.4. Применение современных методов флуорометрии для изучения структуры и функций отдельных митохондрий в клетках и суспензии выделенных органелл

1.1.5. Строение и функции порина во внешней мембране митохондрий

1.2. Флуоресцентная корреляционная спектроскопия теория и приложения

1.2.1. Исторические аспекты развития метода.

1.2.2. Экспериментальная реализация метода

1.2.2.1. Схема установки для флуоресцентной корреляционной спектроскопии.
1.2.2.2. Конфокальный объем и способы его определения
1.2.2.3. Автокорреляционная функция
1.2.2.4. Гистограмма распределения интенсивностей
1.2.3. Применение техники флуоресцентной корреляционной спектроскопии в биофизике.
1.2.3.1.Изучение взаимодействия и агрегации биомолекул.
1.2.3.2. Использование метода ФКС для изучения кинетики химических реакций биологическиактивных молекул.
1.2.3.3. Применение метода флуоресцентной корреляционной спектроскопии для изучения движения отдельных молекул в проточных системах.
1.2.3.4. Применение метода анализа гистограмм интенсивности
ф л у оресценщ 1И.
1.2.3.5. Анализ пиков флуоресценции в суспензии ярких частиц
1.3. Предпосылки изучения митохондрий методом ФКС
Глава 2. Материалы и методы
Глава 3. Результаты
3.1. Автокорреляционный анализ флуктуаций флуоресценции суспензии митохондрий, окрашенных флуоресцентными красителями
3.2. Временные зависимости интенсивности флуоресценции для суспензии митохондрий, окрашенных потенциалзависимыми флуоресцентными красителями сафранином О и этиловым эфиром
тетрамстилродамина
3.2.1.Исследование взаимодействия сафранина О с митохондриями методом ФКС.
3.2.2.Исследование взаимодействия этилового эфира тетраметилродамина с митохондриями методом ФКС
3.3. Метод анализа амплитуд пиков флуоресценции ААП.
3.3.1. Разработка подхода на модельных системах.
3.3.2. Применение метода анализа амплитуд пиков флуоресценции к суспензии выделенных митохондрий7.
3.4. Определение мембранного потенциала выделенных митохондрий
в суспензии и на уровне одиночных частиц
3.5. Исследование взаимодействия флуоресцентных митохондриальных индикаторов потенциала и красителя оксонола VI с субмитохондриальными частицами
3.6. Изучение функционального состояния порина внешней мембраны
выделенных митохондрий.
Заключение.
Выводы.
Список цитируемой литературы


В соответствие с одной из теорий старения, митохондрии играют ключевую роль в производстве активных форм кислорода, которые значительно влияют на продолжительность жизни 7. В мышечной ткани они, возможно, образуют надклеточную, а именно органную структуру за счет контакта митохондрий одной клетки с митохондриями соседних, названную нексусом 8. Образование электрического кабеля митохондриями позволяет передавать, мембранный
потенциал во все части клетки. АТФсинтазой за счет распространения мембранного потенциала из участков, благоприятных для генерации протондвижущей силы 9. В случаях, когда клетки не обладают протяженными митохондриями,, их транспорт возможенпутем скачкообразных движений. Резкие изменения концентрации ионов. Это делает нейрональную деятельность зависимой от митохондрий, как. АТФ, способных также накапливать большое количество, ионов кальция Митохондрии транспортируются по нейронным отросткам к зонам с высоким метаболизмом и. Митохондрии отвечают за. Как впоследствии оказалось, большинство из них сигнальные молекулы. Синтез стероидов протекает в двух комиартментах митохондриях стероидогенной тканш и. На начальной стадии, холестерин транспортируется в митохондрию. Р0зсс он превращается в прегненолон, который выходит из митохондрии в цитозоль, претерпевая там дальнейшие превращения сначала в прогестерон, а . Пагидропрогестерон и наконец, в. Митохондрии содержат ферменты цикла трикарбоновых кислот, в ходе которого происходят взаимные превращения двух и . С и восстановленных эквивалентыЫАДН2 и ФАДН2 Г, и1 частично ферменты цикла мочевины, превращающие токсичный аммиак в нетоксичный продукт мочевину. Две из пяти реакций цикла мочевины происходят в митохондриях, а остальные три в цитоплазме клеток . Большое количество работ посвящено изучению роли митохондрий в апоптозе клеток . В работах Кремера и Ванга было показано освобождение соответственно апоптозиндуцирующего фактора и цитохрома с из митохондрий обязательных событий для запуска некоторых типов терминальных стадий апоптоза . Таким образом, митохондрии В клетке играют важную роль в поддержании нормальной жизнедеятельности, а также принимают участие в таких процессах, как старение и смерть клетки, что говорит о важности исследований строения и функций этих органелл. Хемиосмотическая теория Митчелла. Как было описано ранее, одной из основных функций митохондрий в клетках является синтез АТФ. Он сопряжен с генерацией на внутренней мембране митохондрий разности электрохимических потенциалов ионов водорода. Наряду с электрической компонентой Аср, электрохимический потенциал ионов водорода ДрН, являющийся движущей силой фосфорилирования, включает и осмотическую концентрационную компоненту. Эта компонента представляет собой разность концентраций свободных ионов водорода между двумя отсеками, разделенными мембраной ДрН. Важным моментом в становлении хемиосмотической теории явилось ее экспериментальное доказательство. До сих пор считается, что одним из самых совершенных доказательств существования трансмембранного потенциала ионов водорода на сопрягающих мембранах является использование синтетических проникающих ионов . Так как внутренняя мембрана не проницаема для катионов малого размера вследствие высокой плотности заряда на молекуле, обуславливающей высокий уровень ее сольватации, можно ожидать, что проницаемыми для митохондрий будут молекулы достаточно большого молекулярного веса, с высоким уровнем гидрофобности, с системой сопряженных двойных связей, в результате чего заряд через систему тссвязсй делокализуется по большей части молекулы. Всеми этими свойствами обладают молекулы тстрафенилфосфония, что обуславливает их высокую проницаемость через фосфолипидную мембрану. Транспорт ионов одно и двухвалентных металлов также возможен, но лишь при помощи специальных переносчиков типа валиномицина, нигерицина, грамицидина специфичных для натрия ,калия, кальция и пр. Синтетические ионы с делокализованным зарядом были впервые применены В. П. Скулачевьтм и сотруднкиами. Было показано, что митохондрии осуществляют накопление проникающих катионов, а субмитохондриальные частицы проникающих анионов. Так как , .