Пространственная структура цитотоксинов Naja oxiana и их взаимодействие с мицеллами и биомембранами

• Автор: Дубинный, Максим Анатольевич
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 97 с. : ил.

Оглавление
Введение

Глава 1. Обзор литературы

1. Семейство трехпетлевых трехпальцевых белков из яда змей

2. Структурные исследования цитотоксинов.

Глава 2. Результаты и обсуждение

1. Исследование структуры ЦТ 1 методом ЯМР

1.1. Приготовление образцов и сбор ЯМР данных .

1.2. Отнесение сигналов и расчет структуры.

1.3. Поиск прочно связанных молекул воды в ЦТ 1. . .

2. Исследование ионогенных групп ЦТ I и ЦТ II

2.1. Анализ данных по рНзависимости химических
сдвигов цитотоксинов.
2.2. Ионогенные группы боковых цепей цитотоксина I .
3. Исследование динамического равновесия в системе цитотоксинмицелла ДФХ.
3.1. Модель для анализа химического сдвига в системе
белокмицелла
3.2. Модель для анализа коэффициента трансляционной
диффузии белка в комплексе с мицеллой
3.3. Модели для кп и Мп .
3.4. Эксперименты по измерению зависимости хи
мических сдвигов и трансляционной диффузии цитотоксинов ЦТ I и ЦТ II от концентрации ДФХ
3.5. Анализ изменений химического сдвига и коэффициента трансляционной диффузии цитотоксинов
ЦТ I и ЦТ II.
4. Связывание спинмеченого ЦТ II с модельной липидной
мембраной
4.1. Материалы и методы.
4.2. Модель ГуиЧапмена.
4.3. Связывание СМЦТ с липидной мембраной. .
Заключение
Выводы
Список иллюстраций
Список таблиц
Список сокращений
Литература


В настоящий момент известны аминокислотные последовательности цитотоксина из яда змей рода , из них только для цитотоксинов проводились структурные исследования и получена пространственная структура методом ЯМР или рентгеноструктурного анализа. Пространственная структура цитотоксинов включает два Структура стабилизирована четырьмя консервативными дисульфидными связями. Небольшие различия в аминокислотной последовательности и пространственном строении трех петель цитотоксинов определяют различие в спектре их биологической активности. В настоящий момент не представляет сомнений, что биологическое действие цитотоксинов на клетку включает взаимодействие с липидной мембраной, в частности, с плазматической мембраной клетки. Изучение структуры и функции мембранных белков наталкивается на целый ряд методических трудностей. Мембраносвязанный белок не дает спектра ЯМР высокого разрешения и не может быть закристаллизован, что затрудняет использование стандартных методик определения пространственной структуры белка. Один из путей преодоления данной трудности использование детергентных мицелл, как систем моделирующих мембранное окружение. Вследствие меньшей молекулярной массы детергентные мицеллы позволяют наблюдать спектр ЯМР высокого разрешения и во многих случаях делают возможным расчет пространственной структуры белка. Несмотря на наличие соответствующих методик, в настоящий момент детали взаимодействия цитотоксинов с липидными мембранами недостаточно изучены и вызывают разногласия между различными группами исследователей. Пространственная структура в комплексе с мицеллой получена только для одного цитотоксина, это структура цитотоксина II из яда xi, все остальные структуры получены в водном растворе методом ЯМР или в кристалле методом рентгеноструктурного анализа. За исключением того же цитотоксина II не изучено влияние липидного окружения на пространственную структуру цитотоксинов, недостает прямых данных об участках цитотоксинов, вовлеченных в непосредственное взаимодействие с мембраноймицеллой. Различные исследователи предполагают существование функционально важных комплексов из нескольких молекул цитотоксина на поверхности мембраны, однако прямых подтверждений существования таких комплексов в мембранахдетергентных мицеллах в настоящий момент не получено. Цель исследования. Данная работа ставит целью комплексное изучение двух цитотоксинов из яда кобры xi цитотоксинов I и II методами ЯМР и ЭПР спектроскопии. Получение пространственной структуры цитотоксина I из яда xi в водном растворе и в комплексе с мицеллой ДФХ методом ЯМР высокого разрешения. Измерение рКа боковых цепей отрицательно заряженных аминокислотных остатков, анализ влияния липидного окружения на структуру и свойства заряженных аминокислотных остатков цитотоксина I. Изучение взаимодействия цитотоксинов с мицеллойлипидной мембраной. Мониторинг связывания цитотоксинов с мицеллой методом ЯМР и с липидной мембраной методом ЭПР с использованием спинмеченого аналога цитотоксина II. Методы исследования. В работе применяются методы гомоядерной одномерной и двумерной Н ЯМР спектроскопии высокого разрешения. Для моделирования мембранного окружения при расчете структуры цитотоксина I использованы дейтерированные мицеллы додецилфосфатидилхолина ДФХ. Отнесение сигналов белка производится методом последовательного отнесения сигналов, водородные связи выделяются на основе скоростей дейтерообмена амидных протонов. Ограничения на торсионные углы определяются из значений констант спинспинового взаимодействия. Связанная молекула воды идентифицируется при помощи и спектроскопии, ее наличие проверяется методом молекулярной динамики в явно заданном растворителе. Структура белка рассчитывается на основе ограничений, полученных из двумерных спектров белка и констант спинспинового взаимодействия минимизацией штрафной функции в программе . Константы рКа депротонирования боковых цепей отрицательно заряженных аминокислотных остатков определяются по изменению химических сдвигов в двумерных спектрах ЯМР.