Молекулярная характеризация нового транскрипционного фактора SAYP

• Автор: Шидловский, Юлий Валерьевич
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 135 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СОДЕРЖАНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

I. Аппарат транскрипции у эукариот.

1. Транскрипция у эукариот. РНКпопимеразы.

2. РНКполимераза II.

3. Области контроля транскрипции

Промотор

Проксимальные и дистальные элементы. Энхансеры

.
4. Инициация транскрипции РНКполимеразой II
II. Транскрипционные факторы
1. Компоненты транскрипционного аппарата
2. Общие факторы транскрипции
II.
II.
II.
3. Активаторы и репрессоры
Д1 Iсвязывающие домены
Активационные и рспрсссионныс домены
4. Корегуляторы.

Медиатор
III. Хроматин.
1. Хроматин и транскрипция
2. Гътерохроматин и эухроматин
3. Хроматинремоделирующие комплексы
I группа
II группа.
Механизмы ремоделинга хроматина.
4. Хроматинмодифицирующие комплексы
Гистоновый код
Г истонацетилтрансферазы
СВР. i семейство.
Г истондеацетилазы
5. Взаимодействие хроматинремоделирущих и модифицирующих комплексов
IV. Функционирование аппарата транскрипции i viv.
1. Модульная структура транскрипционного аппарата

2. Комбинаторная модель регуляции транскрипции. Синергизм действия и
контекстзависимая активность факторов транскрипции
3. Регуляция транскрипции
4. Регуляция активности транскрипционных факторов
5. Репрессия транскрипции и сайленсинг.
6. Инициация транскрипции i viv
7. Организация ядра и транскрипция.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
I. ОБЪЕКТ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
1. Реактивы
2. Работа с дрозофилами
3. Программное обеспечение. Базы данных
4. Работа с ДИК
Приготовление компетентных клеток и трансформация. Выделение плазмиднон
ДНК. Рестрикция, лигирование, переосаждение ДНК, гельэлектрофорез
Секвенированне ДНК.
Секвсиирование летального аллеля.
Саузернгибридизация.
Введение радиоактивной метки в ДНКзонд
Клонирование гена еу3
5. Работа с РНК
Выделение тотальной РНК
Очистка ро1уА РНК.
Получение кДНК, .
Нозерн анализ
6. Работа с белками
Экспрессия и очистка рекомбинантных белков.
Получение антител и их очистка.
Белковый гельэлектрофорез.
Иммуноблогтинг.
Иммунопреципнтация.
.
Выделение эмбрионального ядерного экстракта
Фракционирование ядерных белков
Получение белковых экстрактов из эмбрионов.
Хроматография
7. Гибридизация i i
Гибридизация срезов i i
Гибридизация политенных хромосом i i.
8. Илшуноокрашивание.
Иммуноокрашнвание политенных хромосом
Иммуноокрашнваиие ядер с удаленным хроматином
Иммуноокрашивание срезов.
Иммуноокрашивание эмбрионов
III. РЕЗУЛЬТАТЫ.
1. Геномная характеризация гена еу3.
Клонирование гена еу3.
Изучение структуры гена еу3.
Геномная характеризация аллеля еуЗи
Получение и характеризация новой мутации 3i
Картирование других мутаций гена еу3
2. Изучение структуры транскриптов гена еу3.
Изучение структуры с помощью Нозернгибридизации
Картирование с помощью .
Изучение структуры транскриптов у мутантов еуЗи1 и 3i.
изучаемого гена
3. Структурный анализ .
Анализ первичной структуры .
Гомологи . Консервативный домен .
Получение антител к белку.
Иммуноблоттинг
Внутриядерное распределение
4. Анализ экспрессии гена еу3.
Нозерн развития.
Нозерн тканей.
Гибридизация i i
Иммуноокрашивание срезов тканей.
Иммуноокрашивание эмбрионов и личинок.
5. Участие в транскрипции
Локализация на политенных хромосомах.
Хроматографическая очистка.
IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
ВЫВОДЫ.
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Поиск факторов, помогающих полимеразе инициировать транскрипцию, привел к открытию семейства белков, которые вместе обеспечивают специфичное узнавание РНКполимеразой промоторов. Эти факторы известны как основные факторы транскрипции 3,4. В дальнейшем речь пойдет о генах, кодирующих белки и транскрибируемых II. Подобные гены состоят из двух основных элементов регуляторной области, с которой связываются белки транскрипционного аппарата, и кодирующей части, содержащей информацию о структуре кодируемого данным геном белка. Регуляторная область обычно не транскрибируется, с кодирующей части считывается матричная РНК. Регуляторная область представляет собой совокупность коротких последовательностей ДНК, расположенных перед участком старта транскрипции. Эти последовательности, получившие название области контроля транскрипции , необходимы для правильной инициации транскрипции, а также для регуляции ее уровня 1. Основной элемент регуляторной области гена промотор место, с которого начинается синтез РНК молекулами РНКполимераз. Промотор представляет собой участок ДНК от до пар оснований относительно точки старта транскрипции. Главные функции промотора связывание и контроль сборки преинициаторного комплекса, а также обеспечение правильного направления транскрипции. Промоторы эукариот обладают значительным структурным и функциональным разнообразием. В составе промоторов, узнаваемых II, можно выделить ряд так называемый базальных элементов. Базальные элементы являются достаточными для инициации транскрипции и служат мишеныо для посадки полимеразы и основных факторов транскрипции и, таким образом, в совокупности определяют уровень базатьной транскрипции. ТАТАэлемеит расположен за у дрожжей за 0 нуклеотидов до точки инициации транскрипции. Он обнаружен в всех потенцииальных промоторов у дрозофилы и у человека. Это богатый АТ парами элемент с канонической последовательностью . Мононуклеотидные замены в ТАТАэлементе приводят к существенному падению уровня транскрипции гена, в то же время замены в области между ТАТА и стартом транскрипции не оказывают заметного влияния. ТАТАэлемент узнается ТАТАсвязывающим белком ТВР, который является компонентом многосубъединнчного комплекса II. Сайт инициации транскрипции и расстояние от ТАТА до него определяется факторами II и II. ТАТА оказывает действие вне зависимости от наличия другого элемента инициатора. Инициатор I также находится вблизи старта транскрипции и в большинстве случаев определяет его. I обогащен пиримидиновыми основаниями и имеет следующую каноническую последовательность 1 у дрозофилы. I обнаружен в промоторов дрозофилы, чаще всего не содержащих ТАТА промоторов. В присутствии ТАТА, если расстояние между ними составляет Ьр, обнаружен синергизм действия I и ТАТА. Инициатор принимает участие в привлечении II к промотору. Узнавание I осуществляется целым рядом белков 1 и 2 возможно, при участии II и кофакторов I 7, II, III, 1. обнаружен у дрозофилы в около промоторов, треть которых также содержит ТАТА. Чаще всего обнаруживается вместе с I, причем действие зависит от наличия и расстояния до I, поэтому оба этих элемента могут рассматриваться как один. представляет собой 7пуклеотидный элемент, его консенсусная последовательность в положении и в положении . С взаимодействует гетеродимер 69. расположен выше ТАТАэлемента и представляет собой 7нуклеотидную консенсусную последовательность в области . Этот элемент узнается II. В опытах i vi показано, что усиливает активированную транскрипцию и подавляет базальную. островки. Для многих генов, в частности, кодирующих белки промежуточного метаболизма генов домашнего хозяйства, показано, что транскрипция может начинаться с многих сайтов, расположенных в области длиной 0 пар оснований.