Молекулярное моделирование внутрифаголизосомальной среды макрофагов млекопитающих для изучения антигенов, синтезируемых патогенными иерсиниями

• Автор: Петрова, Анна Валентиновна
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Саратов
• Количество страниц: 176 с. : 21 ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. БИОФИЗИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ С ЭФФЕКТОРНЫМ ЗВЕНОМ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ МАКРООРГАНИЗМА МЛЕКОПИТАЮЩЕГО И ОСОБЕННОСТИ

ИММУНИТЕТА ПРИ ИЕРСИНИОЗАХ

ГЛАВА 2. ХАРАКТЕРИСТИКА АНТИГЕННОЙ СТРУКТУРЫ ПАТОГЕННЫХ ИЕРСИНИЙ, ПАТОГЕНЕЗА И КЛИНИЧЕСКИХ ПРОЯВЛЕНИЙ

ВЫЗЫВАЕМЫХ ИМИ ЗАБОЛЕВАНИЙ

ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Бактериальные штаммы и питательные среды

3.2. Антигены

3.3. Клеточные линии и культуральные среды.

3.4. Реактивы и растворы.
3.5. Биофизические и иммунохимические методы.
3.5.1. Электрофорез
3.5.2. Непрямой твердофазный иммуноферментный анализ ТИФА
3.5.3. ДОТиммуноаиализ ДИА
3.5.4. Иммуноблоттинг
3.6. Оборудование и приборы
3.7. Лабораторные животные.
3.8. Статистические методы.
ГЛАВА 4. БИОФИЗИЧЕСКОЕ МОЛЕКУЛЯРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ, ИМИТИРУЮЩЕЙ I VI ВНУТРИФАГОЛИЗОСОМАЛЬНЫЕ УСЛОВИЯ ПАРАЗИТИРОВАНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ
4.1. Сравнительный анализ пролиферативной активности . i V НИИЭГ на различных питательных средах.
4.2. Стимуляторы роста как компонент экспериментальных питательных сред при биофизическом моделировании условий паразитирования бактерий
i viv
4.3. Изучение зависимости пролиферации чумного микроба в условиях, имитирующих внутреннюю среду фаголизосом, от содержания в питательной среде различных концентраций аминного азота
4.4. Сравнительная характеристика пролиферации вирулентного штамма i 1 при молекулярном моделировании внутрифаголизосомапьной среды макрофагов млекопитающих.
4.5. Зависимость пролиферации бактерий . i V от продолжительности культивирования в физикохимических условиях, приближенных к
внутрифаголизосомальным
ГЛАВА 5. ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ БИОФИЗИЧЕСКОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ ВНУТРИФАГОЛИЗОСОМАЛЬНОЙ СРЕДЫ МАКРОФАГОВ МЛЕКОПИТАЮЩИХ ДЛЯ ДРУГИХ ПАТОГЕННЫХ ИЕРСИНИЙ.
5.1. Пролиферативная активность i на различных питательных средах при молекулярном моделировании условий, приближенных к внутрифаголизосомальным
5.2. Характеристика активности пролиферации . ii в условиях, приближенных к внутренней среде фаголизосомы, на различных питательных средах.
5.3. Изучение зависимости пролиферативной активности возбудителя псевдотуберкулеза от продолжительности культивирования в физикохимических условиях, приближенных к внутренней среде фаголизосом макрофагов млекопитающих.
5.4. Особенности пролиферации кишечноиерсиниозных бактерий в зависимости от продолжительности культивирования в условиях i vi,
приближенных к внутрифаголизосомальным.
ГЛАВА 6. ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЛИ И МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К АНТИГЕНАМ ПАТОГЕННЫХ
ИЕРСИНИЙ, СИНТЕЗИРУЕМЫМ В УСЛОВИЯХ, ПРИБЛИЖЕННЫХ К ВНУТРИФАГОЛИЗОСОМАЛЬНЫМ.
6.1.1. Модификация антигенной структуры бактерий . i, . i и ii при культивировании на экспериментальных питательных средах, имитирующих физикохимические условия фаголизосом
6.1.2. Получение и характеристика поликлональных антител к
эффекторным патогенных иерсиний.
6.1.3. Применение мышиных поликлональных антител для характеристики антигенов, синтезируемых близкородственными иерсиниями в условиях, приближенных к внутренней среде фаголизосомы макрофагов млекопитающих
6.1.4. Изучение особенностей экспрессии эффекгорных при моделировании ранней стадии попадания патогенных иерсиний в инграцеллюлярные условия с помощью гомологичных поликлональных антител
6.2. Получение и применение панели комплементарных моноклональных антител для изучения эпитопной специфичности антигенов i, синтезируемых в условиях, имитирующих внутрифаголизосомальную среду
макрофагов млекопитающих.
ГЛАВА 7. ПЕРСПЕКТИВЫ ПРАКТИЧЕСКОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ПРИНЦИПОВ МОЛЕКУЛЯРНОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ И СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ ДЛЯ РАЗРАБОТКИ МЕТОДОВ ИДЕНТИФИКАЦИИ ПАТОГЕННЫХ ИЕРСИНИЙ
7.1. Дифференциация рСасГ и штаммов псевдотуберкулезных и кишечноиерсиниозных бактерий по способности пролиферировать при низких значениях питательной среды.
7.2. Конструирование экспериментальных тестсистем на основе специфических антител для выявления рСасГ штаммов патогенных иерсиний методами ДИА и иммуноблота.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ЛИТЕРАТУРА
СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ
БВМ белки внешней мембраны
БХ бульон Хоттингера
ДАБ диаминобензидин
ДИА ДОТиммуноферментный анализ
ДМСО диметилсульфоксид
кДа килодальтон
ЛПС липополисахарид
м.кл. микробные клетки
м.м. молекулярная масса
МКА моноклональные антитела
НЦМ нитроцеллюлозная мембрана
ПААГ полиакриламидный гель с додецилсульфатом натрия
ПАФ полный адъювант Фрейнда
ПМЯЛ полиморфноядерные лейкоциты
СМФ система мононуклеарных фагоцитов
ТЕМЭД ,,, тетраметилэтилендиамин
ТИФА твердофазный иммуноферментный анализ
Грис лрмсгидроксиметиламинометан
2,2азиноди3этилбензтиазолин сульфонат
I сердечномозговой бульон
бычий сывороточный альбумин
I ферментмеченный иммуносорбционный анализ
I иммуноглобулины класса
I иммуноглобулины класса А
фосфатносолевой буферный раствор
плазмида кальцийзависимости
фетальная сыворотка
Уор секретируемые белки внешней мембраны иерсиний
белки, участвующие в регуляции низкого кальциевого ответа
ВВЕДЕНИЕ


Личный вклад соискателя заключается в самостоятельном проведении экспериментальных исследований, обработке и интерпретации полученных результатов. Постановка задач исследований осуществлялась научными руководителями д. В.А. Федоровой и д. Ю.Ю. Елисеевым. Препараты очищенных белков Е, В, , любезно предоставлены к. Видяевой и к. А.Н. Микеровым. ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ. Диссертация состоит из введения, обзора литературы 2 главы, собственных исследований 5 глав, заключения, выводов и списка литературы, включающего 3 источника, из них зарубежных 9. Объем диссертации составляет 7 страниц машинописного текста, включая таблиц и рисунков. Глава 1. Взаимодействие двух живых систем патогенной бактерии и макроорганизма млекопитающего представляет собой сложное явление, основу которого составляют организованные и скоординированные физикохимические процессы, протекающие в специфических, динамически меняющихся условиях. При этом обе взаимодействующие биосистемы обладают целым рядом функций и специализированных структур, вовлеченных в реализацию биологического контакта и обладающих уникальными биофизическими и биохимическими характеристиками , . Для осуществления специфической функции надзора за постоянством внутренней среды макроорганизма, сохранения его биологической и видовой индивидуальности, защиты от появления генетически чужеродных молекул и клеток, в частности, болезнетворных бактерий, в организме млекопитающих и человека, существует иммунная система. Это анатомически обособленная лимфоидная ткань, совокупность лимфоцитов, макрофагов, ряда сходных с макрофагами клеток, включая клетки селезенки и эпителиальные клетки Лангерганса, а также специализированные эпителиальные клетки. Иммунная система эволюционно формировалась для защиты макроорганизма от патогенных микробов. Одни из них размножаются внеклеточно в тканях или полостях тела, другие проникают внутрь клеток хозяина. Для разрушения патогенных микробов иммунная система располагает несколькими механизмами, часто называемыми эффекторными системами. К ним относятся нейтрализация специфическими антителами, фагоцитоз, цитотоксические реакции и апоптоз , , , , , . Во всех реакциях приобретенного иммунитета ведущая роль принадлежит лимфоцитам, поскольку они специфически распознают конкретный возбудитель, где бы он не находился, внутри или вне клеток, в тканевой жидкости или в крови. Существуют различные типы лимфоцитов, но основных популяций две Тлимфоциты и Влимфоциты. Последние противодействуют внеклеточным возбудителям и влиянию их продуктов, образуя антитела, молекулы которых способны специфически распознавать и связывать определенные молекулымишени антигены . Выработка организмом антител при иммунитете описывается уравнениями кинетики цепных реакций с разветвленными цепями . Важнейшим фактором неспецифической защиты является фагоцитоз физиологический процесс узнавания фагоцитом микроорганизмов или других чужеродных частиц, контакта с ними, внутриклеточного поглощения и разрушения , , . Захват и переваривание микроорганизмов осуществляются двумя типами клеток, которые И. И. Мечников определил как микро и макрофаги. К микрофагам он отнес ПМЯЛ неделящиеся короткоживущие клетки с сегментированным ядром и набором гранул. ПМЯЛ обеспечивают основную защиту от гноеродных бактерий , , , 1. Макрофаги образуются из промоноцитов костного мозга, затем формируют СМФ, включающую моноциты крови и тканевые макрофаги. Они присутствуют в соединительных тканях и вокруг базальных мембран мелких кровеносных сосудов. Особенно высоко их содержание в легких и печени. В отличие от ПМЯЛ макрофаги долгоживущие клетки с хорошо развитыми митохондриями и шероховатым эндогтлазматическим ретикулумом. Функция макрофагов сводится к борьбе с теми бактериями, вирусами и простейшими, которые способны существовать внутри клеток хозяина, к числу которых относятся патогенные иерсинии. Если одни микроорганизмы сравнительно быстро разрушаются в фагоцитах, то другие способны к длительному внутриклеточному паразитированию и размножению в фагоцитах , .