Регуляторные гены, опосредующие генетическую стабильность и радиочувствительность дрожжей Saccharomyces cerevisiae

• Автор: Колтовая, Наталия Алексеевна
• Шифр специальности: 03.00.01
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Дубна
• Количество страниц: 362 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. МИ IОХОНДРИАЛЬНЫЙ ГЕНОМ ДРОЖЖЕЙ vii

обзор литературы

1.1 Структура митохондриальной ДНК

1.2 Структурная организация митохондрий

1.3 Функции митохондрий. .

1.3.1 Образование энергии

1.3.1.1 Окислительное фосфорилнрование

1.3.1.2 епозитивные и редеиегативные дрожжи.

1.3 2 Образование активных форм кислорода

1 3.3 Метаболизм железосерных белков.
1.3.4 Апоптоз
1.3.4.1 Программируемая гибель клеток млекопитающих.
1.3.4.2 Программируемая гибель дрожжей
1.4 Наследование митохондрий
1.5 Наследование митохондриальной ДНК.
1.6 Репликация митохондриального генома
1.7 Сегрегация митохондриального генома.
1.8 Индукция мутаций i бромистым этидием.
1.9 Репарация митохондриальной ДНК
1. Нарушения митохондриального генома и его наследования вызывают
заболевания человека
1. Выделение мутаций , снижающих спонтанную гюмутабильностьЮ
Получение мутаций
Попарное взаимодействие мутаций 2, 3 и i5
1 .3 Влияние мутаций 5 на спонтанную 7юмутабнльность.
Влияние мутаций на гшмутагенез под действием ВЭ
Влияние мутаций на стабильность хромосом.
Влияние мутаций 5 на стабильность рекомбинантных плазмид
Картирование мутации
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Линии.
2.2 Плазмиды и библиотека геномной ДНК дрожжей
2.3 Состав сред и растворов.
2.4 Основные методики.
ГЛАВА 3. ПОЛУЧЕНИЕ И СВОЙСВА МУТАЦИЙ 9 ОДНОВРЕМЕННО СНИЖАЮЩИХ СПОНТАННУЮ МУТАБИЛЬНОСТЬ И МИ ГОТИЧЕСКУЮ СТАБИЛЬНОСТЬ ХРОМОСОМ.
3.1 Получение мутаций гт8, I2, I5 и .
3.2 Попарное взаимодействие мутаций чгм8, ыт2,
3.3 Фенотипические особенности отобранных мутантов
3.3.1 Форма клеток
3.3.2 Время генерации.
3.3.3 Хронологическое старение
3.3.4 Характер почкования
3.4 Влияние мутаций на митохондриальную гюмутабилыюсть
3.4.1 Влияние мутаций на спонтанную гкЛмутабилыюсть.
3.4.2 Влияние мутаций на гюмутаенсз под действием бромистого
этидия.
3.4.3 Влияние мутаций на индукцию мутаций г под действием УФсвета .
3.5 Мутации и точечный митохондриальный мута енез.
3.6 Рекомбинация и сегрегация митохондриальных генетических маркеров у мутантов
3.7 Влияние мутаций на теми возникновения ядерных енньх мутаций
и митотической рекомбинации.
3.8 Влияние мутаций на митотическую стабильность хромосом.
3 9 Влияние мутаций на митотическую стабильность рекомбинантных
плазмид.
3. Влияние нарушений митохондриального генома на стабильность плазмид.
3. Обсуждение.
ГЛАВА 4. КАРТИРОВАНИЕ, КЛОНИРОВАНИЕ И СЕКВШИРОВАНИЕ ГЕНОВ
4.1 Ген 5
4.1.1 Локализация гена
4.1.2 Влияние различных аллелей на скорость размножения
4.1.3 Влияние различных аллелей на спонтанный мутагенез
4.1.4 Влияние различных аллелей на радиочувствительность
4.1.5 Определение нуклеотидной последовательности аллеля
4.1.6 Молекулярнодинамическое моделирование киназы
4.1.7 Ген обсуждение.
4.2 Ген 8
4 2.1 Картирование мутации ьгт
4.2.2 Клонирование и идентификация нуклеотидной последовательности
гена
4.2.3 Определение нуклеотидной последовательности аллеля 8
4.2 4 Ген I обзор литературы
4.3 Ген .
4.3.1 Клонирование и идентификация нуклеотидной последовательноеи
гена .
4.3.2 Определение нуклеотидной последовательности аллеля 2i .
4.3.3 Ген 1I обзор литературы
4.4 Обсуждение
ГЛАВА 5. МОДИФИКАЦИЯ ГЕНАМИ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К у ИЗЛУЧЕНИЮ И IКОНТРОЛЯ
5.1 Чувствительность мутантов к уизлучению
5.1.1 Чувствительность гаплоидных клеток мутантов к летальному действию уизлучения и УФсвета
5.1.2 Чувствительность диплоидных мутантов к летальному действию уизлучения
5.1.3 Взаимодействие мутаций , ьгт2 и 5.
5.1.4 Влияние элиминации митохондриального генома на радиочувствительность штаммов дикого типа и мутантов и 2.
5.1.5 Пострадиационное восстановление жизнеспособности мутантов
5.1.6 Пострадиационное восстановление жизнеспособности дыхательнонедостаточных мутантов с генотипом , 2,
5.2 Взаимодействие i еиов с генами репарации и iконтроля.
5.2.1 Мугация и эпистатические группы мутаций чувствительности к ионизирующему излучению 6 и .
5.2.2 Взаимодействие гена 5 с iгенами 9, ,
, .
5.2.3 Взаимодействие между iгенами 9, I 7,
5.2.4 Взаимодействие гена с 1енами 9, , .
5 2.5 Взаимодействие гена с iгенами 9, , ,
5.2 6 Взаимодействие гена с iгенами , 9,
,
5.3. Участие генов в iконтроле
5 3 1 Влияние мутаций на остановку клеточного цикла в 0 и 1 иод действием УФсвета
5.3.2 Участие генов 8 и в остановке деления клеток в фазе под действием гидроксимочевины
5.3 3 Ген необходим для остановки клеточного цикла в фаю 2 при повреждении ДНК у мутантов 9 и 6 при испсрмиссивнои температуре
5.3.4 Остановка деления клеток в фазе 2 при повреждении ДНК под действием уизлучения.
5.3.5 Влияние iгенов на мутабилыюсть митохондриального генома
5.4 Обсуждение
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
ЛИТЕРАТУРА


Схема процессов, протекающих в митохондриях. Взаимодействия между митохондриальным окислительным фосфорипированием и 1 образованием энергии АТФ 2 образованием АФК и 3 инициацией апоптоза при активации митохондриальных пор . Комплекс дыхательных ферментов, участвующих в окислительном фосфорилировании комплекс I убихиноноксиредуктаза, включающий флавинмононуклеотид и 6 центров комплекс II сукцинат убихиноноксиредуктаза, включающий флавинадениндинуклеотид, 3 центра и цитохром в комплекс III убихинолцитохром соксидоредуктаза, включающий цитохром в, и 1 центр комплекс IV цитохром соксидаза, включающий цитохромы , и СиВ комплекс V АТФсинтетаза. В процессе гликолиза глюкоза превращается в пируват. В аэробных условиях пируват проникает в митохондрии. В матриксе протекает окислительное декарбоксилирование пирувата, катализируемое пируватдегидрогеназным комплексом с образованием ацетилСоА, который совместно с оксалоацетатом ОАА вступает в цикл трикарбоновых кислот ТСА. Лактат дегидрогеназа превращает избыток пирувата и в лактат. Небольшие молекулы диффундируют через внешнюю митохондриальную мембрану, используя канал V потенциалзависимый анионный канал или порин. Канал V совместно с АТФАДФтранслоказой, Вах и циклофелином Д собираются в местах сближения внутренней и внешней мембраны митохондрий, образуя . Проапоптотический белок Вах и взаимодействует с антиапоптотическим белком Вс и бензодиазепиновым рецептором . Открывание пор вызывает выход белка I и цитохрома с с и активацию цитохромом с белка 1 и прокаспазы 9. Активированная каспаза 9 затем инициирует протеолитичсскую деградацию клеточных белков, приводящую к гибели клетки. Таким образом, изменения внутри клеточного , опосредованные митохондриями, могут на ранних этапах регулировать активацию касиаз в митохондриальном пути апоптоза. Митохондрии не только служат энергетическими станциями эукариотических клеток, но также исполняют главную роль в запуске апоптоза посредством выделения индуцирующих его факторов, таких как цитохром с и I рис. Однако цитохром с не всегда является необходимым звеном апоптозной цепи Тоныпин и др. Каспаза может активировать каспазу9 без его участия ii а. На изолированных митохондриях печени показано, что выход цитохрома с может быть Са2зависимым или Са2независимым v i. В первом случае, повышение внугримитохондриальной концентрации Са2 вызывает открывание поры, приводящее к высвобождению цитохрома с. Са2незавнсимый выход цитохрома с контролируется белками семейства 2 i2. Белки семейства Вс регулируют апоптоз на уровне митохондрий. Одни белки этого семейства 2, x, , 1, и предотвращают апоптоз другие проапоптозные Вах, , , x, Вак, i, i, i, Кгк и способствуют самоубийству vv . Проапоптозные белки этого семейства, в покое обычно связанные с цитоскелетом, при запуске апоптоза переносятся в митохондрии, где инактивируют встроенные в их мембраны антиапоптозные белки. Вах образуют ионные каналы в искусственных мембранах, что позволяет предполагать регуляцию апоптоза через образование пор. Вс действует как антиоксидант и блокирует выход цитохрома с. Баланс апоптозных и проапоптозных белков определяет судьбу клетки. Лизосомная цистеиновая протеаза катепсин В также принимает участие в апоптозе. Каспаза8 вызывает выход активного катепсина из лизосом рис. Цитозольный белок i расщепляется каспазой8, активируемой через рецепторы смерти, и лизосомными протеазами катепсинами iii . Образующийся активный белок, так называемый усеченный i i, изменяет конформацию другого проапоптозного белка Вах, после чего тот встраивается во внешнюю мембрану митохондрий, где образует комплекс с порином. Вместе они образуют канал, по которому из межмембранного пространства выходят цитохром с и другие проапоптозные белки v, . В ряде случаев апоптоз реализуется в результате комбинированного действия двух путей с участием рецепторов плазматической мембраны и митохондриального цитохрома с. Так, повреждения ДНК ведут к накоплению в клетке белка р, который может останавливать деление клеток иили индуцировать апоптоз см. V, .