Бактериофаги и биосорбенты на их основе для специфической детекции клеток Escherichia coli биолюминесцентным методом

• Автор: Миних, Ольга Александровна
• Шифр специальности: 02.00.15, 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 118 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Патогенные бактерии и методы их детекции

1.1. Патогены. Ущерб от патогенов

1.2. Стандартные методы детекции.

1.3. Быстрые методы.

1.4. Вид ii i. Детекция патогенных клеток .i

2. Бактериофаги.

2.1. Общие сведения о бактериофагах.

2.2. Литическис и лизогенные бактериофаги

2.3. Применение бактериофагов для детекции бактерий

2.4. Применение бактериофагов как биосорбситов.
3. Биосснсоры.
3.1. Общие сведения.
3.2. Биосенсоры на основе клеточных тканей.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
1. Бактериофаги и бактериальные штаммы
2. Методики проведения экспериментов
2.1. Взаимодействие клеток .i В с бактериофагами в растворе.
2.2. Получение биосорбентов на основе фагов.
2.3. Оценка способности связывания клеток полученными биосорбептами.
2.4. Исследование литической активности биосорбентов на основе фагов
2.5. Детекция клеток .i В на основе нанофильтров i и фага Т4 в растворе
2.6. Анализ данных
2.7. Взаимодействие патогенных и непатогенных штаммов .i с эпителиальными клетками.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Взаимодействие бактерий .i В с бактериофагом Т4 и его рекомбинантными аналогами Т4ВССР и 4 в растворе
1.1. Определение оптимальных условий для прямой детекции клеток .i В с помощью бактериофага Т4 и метода биолюмииесцентной АТФметрии
1.2. Ингибирование роста светящихся клеток .i В при взаимодействии с диким Т4 фагом, биотинилированным Т4ВССР и целлюлозосвязывающим 4 фагами
1.3. Изучение лизиса клеток .i В посредством фага дикого тина Т4 и рекомбинантных фагов Т4ВССР и 4 по данным метода биолюмииесцентной АТФметрии.
2. Биосорбенты на основе иммобилизованных фагов. Их свойства и возможность применения для детекции клеток .i
2.1. Иммобилизация бактериофагов на магнитных и целлюлозных чаешцах
2.2. Исследование свойств полученных биосорбентов
3. Использование нанофильтров i и бактериофага Т4 для специфической детекции клеток .i.
3.1. Построение биосорбента на основе нанофильтров и фага Т4 и исследование его стабильности.
3.2. Сравнение инфекционных свойств системы бактериофаг Т4 нанофильтры с использованием светящихся клеток .i В x
3.3. Исследование возможности специфической детекции клеток .i при помоши биосорбента на основе нанофильтров с бактериофагом Т
3.4. Исследование инфекционных свойств биосорбентов разных типов при использовании светящихся клеток .i В x.
4. Взаимодействие патогенных и иепатогенных биолюминесцентпых штаммов .i с эпителиальными клетками.
4.1. Биолюминесценция штаммов Е i x.
4.2. Рост бактериальных клеток .i в различных средах.
4.3. Адгезия бактериальных клеток . i к эпителиальной ткани.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
ПРИНЯТЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ
II Гемолитический уремический синдром
.i x Светящиеся клетки .i, содержащие полный i. оперон
Отношение концентрации фага к концентрации бактерий в образце
Фосфатный буфер с 7,2, если не указано другое
Фосфатный буфер 7,2 с 0,
АТФ Аденозинтрифосфат
Комнатная температура
Минимальная среда Дэвис, содержащая 1 Декстрозы
Биолюминссцснтный люциферазный реагент
ДМСО Днметилсульфоксид
Минимальная среда Игла
Сыворотка крови телят
Поражение по механизму нрикрсплениясглаживания
Время до начала детекции времена
Интенсивность в относительных световых единицах
I Иммуноферментныи анализ
ИМО Иммуномагнигное осаждение
ПЦР Полимеразная ценная реакция
КОЕ Колониеобразующие единицы
БОЕ Бактсриофагообразуютцнс единицы
Биотиисвязываюший белок
Целлюлозосвязывающий домен
4 Биотшшлированный Т4бактериофаг
4 Целлюлозосвязывающнй Т4бактериофаг
Зелный флуоресцирующий белок
редел обнаружения
Предел количественного определения
Минимальный уровень детекции сигнала
I. Минимальный уровень количественной детекции сигнала
Стандартное отклонение
Количество повторов эксперимента
Работы с патогенными штаммами проводилась в Канадском Исследовательском Институте по Безопасности Пищи Университета г. Гвельфа, Канада. Автор выражает огромную благодарность профессору, директору Института по Безопасности Пищи М. У. Гриффитсу за предоставление уникальной возможности проведения работы в Институте.
ВВЕДЕНИЕ


Тем не менее, эффективность связывания патогенных бактерий не превысила , возможно изза низкой концентрации активных бактериофагов на поверхности биосорбснта. Направленная ориентация осуществляется путем иммобилизации фага на подложку через его капсид, часть фага, главная функция которой сохранение генетического материала вируса . Эта часть располагается на конце хвоста фага противоположном от его основания и фибр, отвечающих за специфичность и лизис клетки. Тем самым, модификация белков фагового капсида, путем введения аффинной метки, может обеспечить высокоэффективную, направленную иммобилизацию. Помимо этого, интерес представляет использование новых высокоэффективных фильтров на основе наноалюминиевых волокон, которые обеспечивают высокую неспецифическую адсорбцию фагов иили бактерий . Положительный зета потенциал этих фильтров может обеспечить направленную иммобилизацию бактериофагов через отрицательно заряженный капсид. Таким образом, в данной работе для увеличения чувствительности детекции бактерий рассмотрены два подхода 1 использование иммобилизованного бактериофага, ориентированного на носителе в наиболее выгодном положении путм внедрения аффинных меток на поверхность фагового капсида посредством генетической модификации и 2 использование новых высокоэффективных фильтров на основе алюминиевых нановолокон, которые неспецифически связывают фаг иили бактерии. Ориентированная аффинная иммобилизация бактериофагов на поверхности биосорбента подход 1 может обеспечить максимальную эффективность связывания и лизиса бактерий за счет того, что специфическичувствительные фибры фага направлены в раствор. С другой стороны, значительное увеличение плотности посадки фага на поверхность сорбента при содействии влияния электростатической составляющей подход 2, скорее всего так же приведет к увеличению числа фагов с правильной ориентацией среди всех иммобилизованных фагов на поверхности сорбента. Построенные биосорбенты на основе Т4 бактериофагов были исследованы на способность выделения клеток . АТФметрии. II клетками. Зфосфат и др. Таким образом, мониторинг появления сигнальных молекул в клеткехозяине может служить индикатором присутствия патогенов в образце. Разработка и тестирование различных систем на основе бактериофагов на предмет эффективности выделения и детекции клеток . Т4 в комбинации с новыми алюминиевыми нановолокнистыми фильтрами i. Исследование зависимости между вирулентными свойствами . Получение биосорбентов на основе бактериофагов. Изучение их стабильности. Проверка способности выделенияконцентрирования клеток . В из раствора с помощью разработанных биосорбситов. Применение клеток . В x для изучения влияния фаговых сорбентов на рост бактерий. Исследование возможности использования комбинации разработанных биосорбситов и биолюмннесцентного АТФанализа для одновременного концентрирования и детекции клеток . В. Сравнение с эффективностью метода прямой детекции в системе бактериофаг Т4. Исследование кинетики роста светящихся штаммов . Исследование зависимости адгезивой способности различных штаммов . Патогенные бактерии и методы их детекции. Патогены. Ущерб от патогенов. Патогенные микроорганизмы. В настоящее время контроль качества пищевой продукции1 ведтся при помощи стандартных методов культивирования. Различные протоколы для детекции определенных бактерий и их штаммов могут быть найдены в Европейском, стандарте 4 Лабораторное обслуживание здоровья, Британия и Кратком руководстве по аналитическим методам, Канадская Организация Здоровья и др. Стандартные методы культивирования высоко чувствительны, относительно недороги и дают достоверный качественный и количественный результат о том, какие микроорганизмы присутствуют в образце 3. Стандартные методы можно разбить на четыре этапа. Первый этап этап неселективного инкубирования, восстановления голодающих микроорганизмов второй этап инкубирование в селективной среде, что увеличивает концентрацию детектируемых организмов. Третий этан выращивание колоний предполагаемых бактерий на селективном агаре.