Иммобилизованные на полимерных носителях гликозидазы - катализаторы гидролиза гетерополисахаридов

• Автор: Ожимкова, Елена Владимировна
• Шифр специальности: 02.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 139 с.

Введение

1 Литературный обзор

1.1 Гидролитические ферменты

1.1.1 Гликозидазы

1.1.2 Ферментный комплекс ТгсЬосегта угс

1.2 Ксиланазы

1.2.1 Общая характеристика ксиланаз

1.2.2 Механизм каталитического действия

1.2.3 Применение ксиланаз

1.3 Иммобилизация ферментов

1.3.1 Методы иммобилизации ферментов

1.3.2 Практическое использование иммобилизованных
ферментов
1.3.3 Иммобилизация гликозидаз
1.4 Растительные олигосахариды
1.4.1 Общая характеристика олигосахаридов
1.4.2 Применение растительных олигосахаридов
1.4.3 Получение олигосахаридов
1.5 Ферментативный гидролиз полисахаридов
1.5.1 Общая характеристика растительных полисахаридов
1.5.2 Ультразвуковая экстракция полисахаридов из
растительного сырья
1.5.3 Применение растительных полисахаридов
1.5.3.1 Полисахариды валерианы лекарственной
1.5.3.2 Полисахариды льна обыкновенного
2 Методы и методики экспериментов и анализов
2.1. Выбор объекта исследований
2.2 Методики получения субстратов
2.2.1 Экстракция полисахаридов валерианы лекарственной
2.2.2 Методы анализа и контроля процесса экстракции
полисахаридов валерианы лекарственной
2.2.2.1 Высокоэффективная жидкостная хроматография
Инфракрасная Фурье спектроскопия
2.3 Экстракция полисахаридов льна
2.3.1 Обоснование выбора сорта льна
2.3.1.1 Определение концентрации гликанов в экстрактах
2.3.1.2 Определение содержания редуцирующих сахаров
2.3.1.3 Динамическое светорассеяние
2.3.2 Методика ультразвуковой экстракции полисахаридов
2.3.3 Методы анализа и контроля ультразвуковой экстракции полисахаридов семян льна
2.3.3.1 Определение сухого остатка
2.3.3.2 Измерение вязкости экстрактов
2.4 Методика проведения кислотного гидролиза полисахаридов
льна и валерианы лекарственной
2.5 Методика получения катализаторов
2.5.1 Характеристика носителей
2.5.2 Синтез катализаторов
2.5.2.1 Методика получения каталитических систем на
основе БЕРАВЕАГ ЕСЕР
2.5.2.2 Методика получения каталитических систем на
основе БЕРАВЕАОВ ЕСНА
2.5.2.3 Расчет степени адсорбции и иммобилизации
ферментного препарата
2.6 Определение оптимальных условий и кинетических параметров действия ферментного комплекса ТгсЬобегша угсЗ
2.7 Гидролиз полисахаридов льна ферментным комплексом ТгсЬобегша угсе
2.8 Определение оптимального катализатора
2.9 Подтверждение полиферментной активности каталитической
системы
2. Физикохимические методы исследования образцов
катализаторов
Рентгенофотоэлектронная спектроскопия
Исследование поверхностных характеристик катализаторов низкотемпературной адсорбцией азота
2. Методы клинических испытаний олигосахаридов
валерианы
2. Использованные реактивы
3 Результаты экспериментов и их обсуждение
3.1 Экстракция гетерополисахаридов из растительного сырья
3.1.1 Анализ полисахаридов валерианы лекарственной
3.1.1.1 Характеристика полисахаридных экстрактов методом ВЭЖХ
3.1.1.2 Характеристика полисахаридных экстрактов
методом ИК спектроскопии
3.1.2 Экстракция полисахаридов льна
3.1.2.1 Обоснование выбора сорта льна
3.1.2.2 Определение оптимальных условий и методы
контроля ультразвуковой экстракции полисахаридов льна
3.1.3 Результаты кислотного гидролиза полисахаридов
валерианы лекарственной и льна обыкновенного
3.2 Оптимизация состава катализаторов
3.3 Результаты физикохимические исследований
3.3.1 Инфракрасная Фурье спектроскопия
3.3.2 Рентгенофотоэлектронная спектроскопия образцов
3.3.3 Исследование поверхностных характеристик образцов
3.4 Определение условий проведения экспериментов по гидролизу гетерополисахаридов
3.5 Определение условий действия иммобилизованного ферментного комплекса ТпсЬоегта угс
3.6 Определение кинетических характеристик катализатора Н2МЕ
3.7 Операционная стабильность катализатора Н2МЕ
3.8 Результаты клинических испытаний
Выводы
Список использованных источников


В связи с этим, создание и установление свойств стабильных катализаторов на основе иммобилизованных на твердом полимерном носителе комплекса ферментов для гидролиза гетерополисахаридов является актуальным, перспективным и экономически выгодным направлением исследований. Цель работы заключается в разработке эффективных катализаторов гидролиза растительных гетерополисахаридов на основе иммобилизованного гл и колитического ферментного комплекса гриба ТпсЪосЛегта угме. Научная новизна и практическая значимость работы. В работе теоретически обоснована и экспериментально подтверждена целесообразность использования полимерных носителей для иммобилизации гликолитичсского ферментного комплекса гриба ТпсИос1егта уичЛе. Впервые изучено влияние модификации носителя на активность и стабильность полученных катализаторов, а также проведен сравнительный анализ синтезированных катализаторов на основе двух различных полимерных носителей. На основе модифицированного глутаровым альдегидом носителя получена каталитическая система, сохраняющая активность в течение циклов. На основании экспериментальных данных определены кинетические параметры процессов ферментативного гидролиза ксилана, полисахаридов льна обыкновенного и валерианы лекарственной оптимальной каталитической системой. Подобраны оптимальные условия реакций гидролиза гетерополисахаридов для накопления максимального количества три и пентаолигосахаридов в реакционной среде. Впервые предложены эффективные методики получения доступных гетерополисахаридов, являющиеся перспективными субстратами для ферментативного получения олигосахаридов. Доказана эффективность использования ультразвукового воздействия на процесс экстракции полисахаридов льна, что позволяет существенно сократить время экстракции. Апробация работы. Москва, , гг. XV и XVI Международных конференциях студентов, асиирантов и молодых ученых Ломоносов Москва, , г. Международного форуме Аналитика и аналитики Воронеж, , XIII Международной Пущинской школыконференции молодых ученых Биологиянаука XXI века Пущино, . Гидролитические ферменты гидролазы, КФЗ это класс ферментов, катализируюших реакции гидролитического с участием воды расщепления внутримолекулярных связей. Гидролазы широко распространены в клетках растений и животных. Участвуют в процессах обмена белков, нуклеиновых кислот, углеводов, липидов и других биологически важных соединений. По химической природе большинство гидролаз простые белки для проявления их каталитической активности необходимо наличие неизмененных сульфгидрильных ОЗН групп, занимающих определенное положение в полипептидной цепи. Ряд гидролаз получен в кристаллическом виде уреаза, пепсин, трипсин, химотрипсин и др Механизм каталитического действия исследованных гидролаз включает соединение фермента с расщепляемым веществом с последующим отщеплением продуктов реакции и освобождением фермента. Каталитически активными группами в гидролазах являются группа ОН остатка серина группа ЗН остатка цистеина группа СООН остатков аспарагиновой и глутаминовой кислот имидазольная группа остатка гистидина. Эти группы функционируют как нуклеофильные катализаторы, образуя с субстратом промежуточные соединения или как кислотноосновные катализаторы, способствуя отщеплению протона от молекулы Н2О, атакующей расщепляемую связь, и протонируя уходящую группу субстрата. Атомы металла в металлсодержащих гидролазах поляризуют расщепляемую связь, включая в свою координационную сферу молекулу Н, способствуя се ионизации 1. ГГо международной классификации ферментов гидролазы отнесены к классу КФ 3, который, в свою очередь, подразделяется на подклассов в зависимости от типа гидролизуемой связи таблица 1 2. КФ 3. КФ 3. КФ 3. КФ 3. КФ 3. КФ3. КФ 3. КФ 3. КФ 3. КФ3. КФ3. КФ 3. КФ3. Гликозидазы гликозилгидролазы объединены в КФ 3. О или Эгликозидов. Все гликозидазы имеют номера КФЗ. Х, при этом X может принимать значения от 1 до 0 и более в зависимости от субстратной специфичности фермента 3. На основе молекулярного механизма катализируемой ими реакции гликозидазы можно разделить на две группы представители первой группы обращают, а второй сохраняют путм двойного обращения оптическую конфигурацию субстрата у продукта реакции гидролиза рисунок 1.