Применение методов теоретической химии для изучения механизма действия D-аминопептидазы из Ochrobactrum anthropi, апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы человека 1 и выбора среды проведения ферментативной реакции

• Автор: Халиуллин, Ильяс Галиевич
• Шифр специальности: 02.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 92 с. : ил.

Введение

1. Обзор литературы

1.1. Пенициллинсвязывающие белки. Оаминопеггтидаза из ОсНгоЬасЩип апШгор

1.1.1. Общие сведения

1.1.2. Механизм действия ферментов семейства пенициллинсвязывающих белков

по данным литературных источников.

1.1.3. Мутагенетические исследования Оаминопептидазы.

1.2. Апуриноваяапиримидиновая эндонуклеаза 1 человека

1.2.1. Общие сведения.

1.2.2. Механизм действия апуриновойапиримидиновой эндонуклеазы человека

АРЕ1 по данным литературных источников

1.3. Оптимизация условий проведения биокаталитических процессов и органических
растворителях. Метод СОЯМОИБ.
1.4. Методы теоритичсской химии, наиболее часто применяемые в энзимологии и
биотехнологии
1.4.1. Расстановка атомов водорода в кристаллографических структурах. Расчет
состояний ионизации аминокислотных остатков.
1.4.2. Метод моделирования мутантных форм ферментов
1.4.3. Метод молекулярной динамики
1.4.4. Метод молекулярного докинга
2. Постановка задачи
3. Экспериментальная часть
3.1. Методы моделирования
3.1.1. Общее программное обеспечение и средства, использованные при
моделировании.
3.1.2. Моделирование структур мутантных форм ферментов
3.1.3. Моделирование субстратной специфичности и механизма действия Э
аминопептидазы из ОсЬгоЬагит ап1Ьгор
3.1.4. Моделирование структуры ферментсубстратного комплекса апуриновойапиримилиновой эндонуклеазы человека 1 АРЕ1.
.2. Материалы и методы экспериментального исследования
3.2.1. Изучение профиля активности аминопептидазы.
3.2.2. Изучение субстратной специфичности аминопептидазы и сс мутантов
4. Результаты и обсуждение
4.1. Механизм действия апуриновойапиримидиновой эндонуклеазы человека АРЕ1
4.1.1. Молекулярное моделирование ионизационных состояний остатков активного
центра
4.1.2. Связывание субстрата в активном центре фермента.
4.1.3. Каталитическое расщепление фосфодизфирной связи атака активированной
молекулы воды
4.1.4. Анализ связывания субстрата и поиск механизмозависимых ингибиторов.
4.2. Механизм действия аминопсптидазы из i.
4.2.1. Анализ структуры аминопептидазы. Молекулярное моделирование
ионизационных состояний остатков активного центра
4.2.2. Экспериментальное изучение профиля активности
4.2.3. Предлагаемый механизм действия аминопептидазы.
4.2.4. Механизмы действия ферментов семейства пенициллинсвязывающих белков
4.3. Дизайн субстратной специфичности аминопептидазы.
4.3.1. Биоинформатический анализ семейства белков, гомологичных
аминопептидазе, молекулярное моделирование мутантных форм
4.3.2. Виртуальный скрининг и обоснование выбора позиций и замен для
экспериментального получения.
4.3.3. Экспериментальное исследование субстратной специфичности полученных мутантных форм аминопептидазы.
4.4. Разработка метода виртуального скрининга наилучшего растворителя для проведения биокаталитичсских реакций
4.4.1. Описание алгоритма.
4.4.2. Валидация разработанного метода виртуального скрининга растворителя .
Заключение
Основные результаты и выводы
Благодарности.
Приложения
Приложение А. Исходный текст программы на Рег1, реализующей алгоритм ЫВЯА
Список использованной литературы


Пенициллинсвязывающие белки. Мутагенетические исследования Оаминопептидазы. Общие сведения. Метод СОЯМОИБ. Расстановка атомов водорода в кристаллографических структурах. ОсЬгоЬагит ап1Ьгор
3. Моделирование структуры ферментсубстратного комплекса апуриновойапиримилиновой эндонуклеазы человека 1 АРЕ1. Изучение профиля активности аминопептидазы. Связывание субстрата в активном центре фермента. Анализ связывания субстрата и поиск механизмозависимых ингибиторов. Механизм действия аминопсптидазы из i. Анализ структуры аминопептидазы. Предлагаемый механизм действия аминопептидазы. Дизайн субстратной специфичности аминопептидазы. Экспериментальное исследование субстратной специфичности полученных мутантных форм аминопептидазы. Описание алгоритма. Валидация разработанного метода виртуального скрининга растворителя . Благодарности. Приложение А. Рациональный дизайн ферментов с заданными свойствами, создание новых лекарственных препаратов, оптимизация биотехнологий представляют собой комплексное наукоемкое направление, чрезвычайно актуальное в настоящее время. Целенаправленное изменение каталитических свойств ферментов, дизайн новых ингибиторов ферментов и оптимизация условий проведения ферментативных реакций представляют собой важные и сложные задачи как с точки зрения фундаментальной, гак и прикладной науки. Сегодня очевидно, что решение проблем такого уровня сложности не может быть основано только лишь на чрезвычайно трудоемких эмпирических подходах и требует рационального использования достижений современной теоретической химии. Действительно, методы теоретической химии приобретают все большее значение при проведении исследовательских работ. Постоянно возрастающие производительность и доступность компьютерных систем и программных продуктов позволяют исследователям, прежде не имевшим отношения к моделированию, применять вычислительные методы для решения широкого круга своих задач. Не так давно применение расчетных методов в биохимии, молекулярной биологии и эпзимологнн было ограничено изза чрезвычайной сложности и размера биологических систем. В настоящее время разработано множество методов для использования в биотехнологии. Это такие методы, как классическая и гибридная молекулярная динамика, молекулярный докинг, предсказание трехмерной структуры биополимеров, расчет состояний ионизации аминокислотных остатков и другие. В настоящей работе была поставлена задача исследовать возможности применения методов теоретической химии в сочетании с экспериментальными данными для решения задач биокатализа и биотехнологии. Необходимо было изучить механизм реакций, катализируемых аминопептидазой из ii и апуриновойапиримидиновой эндонуклеазой человека 1 АРЕ1 и использовать эти знания для получения ферментного препарата с измененной субстратной специфичностью, а также поиска новых ингибиторов. Наряду с использованием методов теоретической химии для дизайна каталитических свойств фермента и ингибиторов была предпринята попытка i ii подбора наилучшего растворителя для проведения биокаталитических реакций, протекающих в нетрадиционных органических средах. Пенициллинсвязывающие белки. Рис. Производными Эаминокислот являются, например, беталактамные антибиотики ампициллин и амоксициллин, заменитель сахара апитам. Iii i
. Рис. Примеры соединений различных отраслей химической промышленности, являющихся производными Оаминокислот.