Изучение взаимодействия люциферазы светляков Luciola mingrelica с субстратами и их аналогами методом флуоресцентной спектроскопии

• Автор: Власова, Татьяна Николаевна
• Шифр специальности: 02.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 129 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ стр.

ПРИНЯТЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Применение флуоресцентной спектроскопии для изучения физикохимических свойств макромолекул белков

1.1. Собственная флуоресценция белков

1.2. Метод флуоресцентных меток

2. Структура белковой глобулы и активного центра люциферазы светляков

2.1. Структура белковой глобулы

2.2. АТРсвязывающие участки

2.3. Люциферинсвязывающий участок

2.4. Микроокружение излучателя в активном центре люциферазы
2.5. Изменение конформации люциферазы в процессе биолюминесцентной реакции
3. Использование флуоресцентных методов в изучении биолюминесцентной системы люциферазы светляков
3.1. Спектральные свойства люциферина, оксилюциферина и их аналогов
3.2. Спектральные свойства люциферина, оксилюциферина и их аналогов в комплексе с люциферазой
3.3. Тушение собственной флуоресценции люциферазы
в присутствии субстратов и их аналогов
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
1. Исходные вещества и рабочие растворы
2. Используемая аппаратура
3. Методики проведения экспериментов
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Спектральные свойства диметилоксилюциферина и монометилоксилюциферина
1.1. Спектры поглощения и флуоресценции диметилоксилюциферина
1.2. Спектры поглощения и флуоресценции монометилоксилюциферина
1.3. Стабильность и .
1.4. Влияние растворителей на спектры флуоресценции и
2. Взаимодействие люциферазы светляков с диметилоксилюциферином и монометилоксилюциферином
2.1. Ингибирование люциферазы диметилоксилюциферином
2.2. Спектры кругового дихроизма КД рекомбинантной и мутантной i3 люциферазы светляков в отсутствие и в присутствии .
2.3. Флуоресцентное титрование рекомбинантной и мутантной люцифераз люциферином, диметил и монометилоксилюциферинами при различных значениях
2.4. Спектры флуоресценции и возбуждения в комплексе с рекомбинантной и мутантной люциферазами
2.5. Спектры флуоресценции и возбуждения в комплексе с рекомбинантной и мутантной люциферазами
2.6. Поляризация флуоресценции и в комплексе с люциферазой
2.7. Спектральные свойства , , 2 в комплексе с рекомбинантной и мутантной люциферазами
в присутствии АТР АМР.
3. Влияние субстратов и их аналогов на собственную
флуоресценцию люциферазы светляков
3.1. Флуоресценция остатков Тгр и Туг в люциферазе светляков
3.2. Тушение флуоресценции остатков Туг и Тгр люциферазы в присутствии субстратов
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


До настоящего времени подробного изучения спектральных свойств и стабильности этих соединений не проводилось. Поэтому задачей данной работы являлось подробное изучение спектральных свойств и стабильности этих соединений в водных растворах, в различных растворителях и в комплексе с люциферазой. Это позволило получить информацию о физикохимических свойствах микрооокружения излучателя в активном центре люциферазы. Известно 6, что люцифераза светляков фермент, состоящий из двух доменов большого домена и малого Сдомена, соединенных подвижной неупорядоченной петлей. ЬН2 и АТР в результате конформационных изменений с образованием закрытой структуры 7. Однако, какой из субстратов 2 или АТР вызывает такое изменение конформации не известно. Флуоресцентные методы широко используются для изучения взаимодействия ферментов с субстратами, продуктами реакции и другими эффекторами, способными тушить собственную флуоресценцию белков, которая в основном обусловлена остатками триптофана и тирозина 9, . Люцифераза светляков i ii содержит один остаток Тгр и остатков Туг 7. В качестве маркера для исследования взаимодействия люциферазы с люциферином и его аналогами до сих пор успешно использовалась флуоресценция остатка Тгр Яет 0 нм , , , , , . Было показано, что в присутствии 2 происходит тушение флуоресценции остатка Тгр по статическому типу . Второй субстрат АТР, тушит флуоресценцию Тгр по динамическому типу только при концентрациях существенно превышающих Кт ,. Флуоресценция остатков Туг люциферазы до настоящего времени не исследована. По литературным данным существенная тирозиновая флуоресценция Хеш 48 нм наблюдалась для тех белков, у которых содержание остатков Туг больше содержания остатков Тгр . Поскольку люцифераза светляков i ii содержит остатков Туг и только один остаток Тгр, можно было ожидать существенного вклада тирозиновой составляющей в собственную флуоресценцию люциферазы. Известно, что даже незначительные изменения в трехмерной структуре белка могут привести к тушению флуоресценции остатков Туг 9, , . В связи с этим, использование флуоресценции остатков Туг в качестве маркера оказалось перспективным для исследования изменений в структуре люциферазы светляков. Цель работы исследовать взаимодействие люциферазы с субстратами и их аналогами, с помощью флуоресцентных маркеров диметилоксилюциферина и монометилоксилюциферина, а также собственных флуорофоров белка остатков тирозина и триптофана. Изучить спектральные свойства и стабильность и , показать возможность их использования в качестве флуоресцентных маркеров. Сравнить спектральные свойства и в буферном растворе, в комплексе с рекомбинантной и мутантной i3 люциферазой светляков . Определить возможность использования флуоресценции Туг остатков люциферазы в качестве маркера ферментсубстратных взаимодействий. Изучить влияние каждого субстрата на сродство люциферазы ко второму субстрату методом флуоресцентного титрования. Флуоресцентные методы широко используются для изучения свойств биологических молекул, в том числе и белков. Параметры флуорофоров длительность возбужденного состояния, квантовый выход, длина волны в максимуме флуоресценции, форма спектра в большой степени зависят от микроокружения флуорофоров, подвижности белковых глобул, присутствия других флуорофоров и т. Все это позволяет использовать флуоресцентные методы для решения ряда структурных задач. Путем измерения флуоресценции можно получить сведения о конформационных особенностях и внутримолекулярной динамике белков, местах связывания эффекторов, взаимодействии с растворителем, степени гибкости, межмолекулярных расстояниях и коэффициентах вращательной диффузии макромолекул ,,. Выделяют три типа флуорофоров в белках собственные, коферментные и искусственные или внесенные присоединенные к белковым макромолекулам. Поскольку люминесцентная система светляков функционирует без коферментов, то основной интерес представляет использование в качестве флуоресцентных меток собственных флуорофоров белка и взаимодействующих с белком субстратов, продуктов и их аналогов, обладающих флуоресцентными свойствами.