Биосенсоры на основе наноструктурированных пленок полиэлектролитов

• Автор: Соколовская, Лидия Григорьевна
• Шифр специальности: 02.00.15, 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 141 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Структура и свойства тирозиназы.

1.2. Фенольные биосенсоры на основе тирозиназы

1.3. Структура и свойства холиноксидазы.

1.4. Детекция холина с использованием амперометрических биосенсоров.

1.5. Технология последовательного нанесения полиэлектролитов

1.6. Факторы, определяющие структуру нанопленок ионная сила,

, гидратация и высушивание

1.7. Биосенсоры на основе технологии

последовательного нанесения полиэлектролитов ПНП

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
2.1. Материалы.
2.2. Методы .
2.2.1. Метод последовательного нанесения полиэлектролитов ПНП
2.2.2. Изготовление тирозиназных биосенсоров .
2.2.3. Модификация графита полидиэтиламинофосфазеном ПФ
2.2.4. Электромодификация графитовых электродов оксидом МпУ.
2.2.5. Изготовление холиноксидазных биосенсоров
2.2.6. Приготовление образцов для АСМ
2.2.7. Получение АСМизображений.
2.2.8. Обработка топографии поверхностей.
2.2.9. Силовое картирование нанопленок.
2.2 Электрохимический анализ фенола.
2.2 Определение количества тирозиназы в слое
2.2 Электрохимический анализ пероксида водорода.
2.2 Электрохимический анализ холина.
2.2 Снектрофотомстричсское определение активности холинокендазы
2.2 Анализ активности бутирилхолииэстеразы
2.2 Обработка результатов.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Структурные особенности нанопленок, полученных
методом последовательного нанесения полиэлектролитов
3.1.1. Влияние ионной силы на структуру полимера на поверхности
3.1.2. Влияние количества нанесений структуру полиэлектролитов
на поверхности графита
3.1.3. Силовое картирование полиэлектролитных нанопленок
3.1.4. Нанопленки на основе белков
3.1.5. Предобработка графита полидиэтиламинофосфазеиом
3.2. Тирозиназный биосенсор.
3.2.1. Разработка и оптимизация метода послойного нанесения полиэлектролитов для создания тирозиназного биосенсора
3.2.1.1. Влияние природы полиэлсктролита на
активность тирозиназных электродов
3.2.1.2. Влияния концентрации тирозиназы на величину аналитического сигнала тирозиназных электродов
3.2.1.3. Влияние времени адсорбции тирозиназны и
поликатиона на величину аналитического сигнала биосенсоров.
3.2.2. Кинетические параметры тнрозиназы в пленках полиэлектролнтов
ф 3.2.3. Аналитические характеристики тирозиназных биосенсоров
3.2.4. Стабильность тирозиназных биосенсоров
3.2.5. Применение тирозиназных биосенсоров для анализа
активности ферментов
3.2.6.1. Анализа активности бутирилхолинэстеразы
в кинетическом режиме
V З.2.6.2. Количественный анализ щелочной фосфатазы
3.3. Биосенсоры на основе холиноксидазы
3.3.1. Оптимизация системы определения пероксида водорода
на основе графитовых электродов, модифицированных оксидом Мп1У
3.3.1.1. Электрохимические особенности графитовых
электродов, модифицированных оксидом Мп1У
3.3.1.2. Топографические характеристики графитовых
электродов, модифицированных оксидом Мп1У.
3.3.1.3. Оптимизация методики модификации графитовых
ф электродов оксидом Мп1У
3.3.1.4. Аналитические характеристики и стабильность графитовых электродов, модифицированных оксидом Мп1У.
3.3.2. Разработка и оптимизация метода послойного нанесения, полиэлектролнтов для создания холиноксидазного биосенсора
3.3.2.1. Влияние природы полиэлектролита на активность холиноксидазных электродов
Ф 3.3.2.2. Влияние концентрации холиноксидазы в растворе
на величину аналитического сигнала тирозиназных электродов
3.3.2.3. Влияние времени адсорбции холиноксидазы
на величину аналитического сигнала биосенсоров
ф 3.3.3. Кинетические характеристики холииокидазы
в пленках полиэлектролнтов.
3.3.4. Аналитические характеристики и стабильность
холинокидазных биосенсоров.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
Щ ЛИТЕРАТУРА

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ПК поликатион,
ПА полианион,
Тир тирозиназа,
ХО холиноксидаза,
ПЭИ полиэтилснимин,
ПДДА полидиметилдиаллиаммоиийхлорид,
ПАА полиаллилам ни,
ПСС полистиролсульфонат,
ПАК полиакриловая кислота,
ПАС полианетолсульфонат,
БХЭ бутирнлхолинэстсраза,
БСА бычий сывороточный альбумин,
ВОПГ высокоориентированный пиролитический графит,
П4ВБП полилвинилбензилхлоридпиридии,
П4ВП поли4винилпиридин,
ПДМЭАММА полидиметилэтиламмонийэтилметакрилатбромид, ДМАЭМА диметиламиноэтилмстакрилат, ф ПФ полидиэтиламинофосфазен,
АСМ атомносиловая микроскопия ССС сканирующая силовая спектроскопия.
ВВЕДЕНИЕ


Конфигурация СиИ в охуформе тирозиназы является квадратнопирамидальной, что не является типичным для соединений СиН в растворе 1, , . С I I
Рис. Структура активного центра Еоху. Ете,, как и охуформа, содержит два иона II, связанных с шестью остатками гистидина полипептидной цепи Рис. V,, 2
Рис. Структура активного центра Еш. В ряде работ говорится о существовании дополнительной связи между ионами меди, приводящей к квадратнопирамидальной конфигурации II, как и в случае охутирозиназы 1, . Эти предположения основаны на исследованиях искусственно полученной ЭПРдетектируемой формы тирозиназы, содержащей в активном центре ионы II и I и получившей название тирозиназы . Выделенная из природных объектов, например грибов, тирозиназа представляет собой смесь и охуформы . Восстановленная форма тирозиназы Еоху, по аналогии с яохугемоцианином, содержит в активном центре два иона Си1 Рис. Необходимо отметить, что тирозиназа содержит не детектируемые ЭПР атомы меди, поскольку в случае i Еоху форм ионы II объединяют свои неспаренные электроны, перенося их через связывающие их лиганды, что приводит к диамагнитному поведению I, , а в случае x формы в активном центре содержатся диамагнитные ионы I. Сложность изучения структуры тирозиназы заключается также в том, что данный фермент обладает плохой стабильностью и получение его в чистом виде на сегодняшний день является большой проблемой, поэтому рентгеноструктурный анализ тирозиназы не был сделан, и детально структура активного центра этого фермента не изучена. Однако, полученные на основе химического и спектроскопического изучения данные вместе с кинетическими исследованиями фермента позволили предположить механизм реакций, катализируемых тирозиназой, последовательные уточнения которого привели к практически полному согласованию с экспериментальными результатами. Как было сказано выше, тирозиназа катализирует две различные реакции ортогидроксилирование монофенолов гидроксилазная, моиофеиолазная или крезолазная активность и окисление одифеиолов до охинонов оксидазная, дифеиолазная или пирокатсхиназная активность . Наиболее вероятная схема превращения моио и дифенолов под действием тирозиназы, соответствующая экспериментальным результатам, полученным к настоящему моменту, представлен на Рис. Как видно из приведенного на Рис. Еоху форму. Окисленная форма Еоху может связываться как с моно М, так и с одифеиолами . При связывании с монофенолами происходит образование одифенолов и отгформы, а также соответствующих 0ХИНОНОВ 0 С выделением восстановленной формы фермента x. При связывании Еоху с одифенолами происходит образование соответствующих охннонов и яеформы тирозиназы. Рис. Структура активного центра x. Ете1М, не приводящего к выделению одифенолов ИЛИ 0ХИНОНОВ Рис. Рис. Схема действия тирозиназы на моно и дифенольные субстраты. Таким образом, за один каталитический цикл тнрозиназа осуществляет окисление двух молекул одифенола, присоединяя одну молекулу кислорода, и 0гидроксилированис одной молекулы монофенола. Участие ионов меди в механизме действия тирозиназы представлено на Рис. Из приведенной схемы видно, что после взаимодействия Еоху и Етегформ тирозиназы с моно и дифенольными субстратами образовавшиеся ферментсубстратные комплексы через ряд переходных состояний могут приводить к отщеплению продукта и образованию соответствующей формы фермента. В случае взаимодействия тгформы фермента с монофенолом Л атом кислорода Эгруппы субстрата, осуществляющего нуклеофильную атаку фермента, связывается с одним из ионов меди активного центра, в результате чего образуется тупиковый комплекс ЕтМ. При взаимодействии Ете с дифенолом происходит связывание атома кислорода одной 0группы субстрата с одним из атомов меди, после чего атом кислорода второй ОЯгруппы связывается со вторым атомом меди, при этом разрывается связь второго атома меди с одним из гистидииовых остатков полипептндной цепи, находящимся в аксиальном положении. После отсоединения 0хинона аксиальная связь с гистидином восстанавливается, и образуется восстановленная форма фермента x.