Рекомбинантная люцифераза светляков Luciola mingrelica : Получение, свойства, применение

• Автор: Лундовских, Ирина Александровна
• Шифр специальности: 02.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 154 с. : ил

Иса, не уступающей по стабильности нативному ферменту получение препаративных количеств рекомбинантного белка изучение его каталитических свойств и механизма термоинактивации, что позволило получить новые данные о механизме действия фермента и разработать АТФреагент на основе рекомбинантной люциферазы светляков в растворимом и иммобилизованном состоянии. II. Люцифераза светляков люциферин4монооксигеназа гидролиз АТФ люциферинкислород4оксидоредуктаза дскарбоксилирование, гидролиз АТФ, ЕС 1. АТФ и ионов 2 7, рис. I, в результате которой выделяется видимый свет нм с квантовым выходом, близким к единице . В отличие от большинства других оксигеназ, люцифераза не содержит простетических групп, кофакторов или ионов металлов . Особенностью люциферазной реакции является низкая степень превращения субстратов оборот фермента мал изза медленной диссоциации комплекса ферментпродукт, скорость которой соизмерима со скоростью инактивации фермента 7. Работы по клонированию генов люцифераз светляков и получению рекомбинантных белков начались в лаборатории М. ДеЛюка, где в гг. ДНК люциферазы Р. На основе мРНК, выделенной из лампочек светляков, была сконструирована библиотека кДНК в векторе . Экспрессия фага, содержащего вставку чужеродной ДНК в области гена галактозидазы, в клетках . I и X. Было получено 0 тысяч фагов, которых оказались рекомбинантными. Скрининг библиотеки методом гибридизации с антителами к нативной люциферазе

. Рис. Механизм окисления люциферина 7. Р. ругаИв позволил выделить клонов, 8 из которых были проанализированы. Все клоны содержали вставки кДНК. Клон ХЬис, содержащий наибольшую вставку 1,8 тыс. Для выделения полного гена теми же авторами была сконструирована библиотека клонов в А. ЕМВЬ4 . Скрининг проводили с помощью ранее полученного фрагмента гена люциферазы ЬисВ. Были отобраны 4 клона, один из которых был секвенирован. Сопоставлением данного сиквенса с сиквенсом ДНК светляков была реконструирована полная карта гена люциферазы светляков Р. Ш . Общая длина гена люциферазы светляков составляет около нуклеотидных остатков. Кодирующая последовательность состоит из 7 экзонов, которые вместе кодируют аминокислотную последовательность фермента, включающую 0 остатков. В году были клонированы люциферазы жуковщелкунов i, способных испускать свет 4 цветов от зеленого до оранжевого в различных частях одного организма 5. На основе мРНК была сконструирована библиотека кДНК в векторе . Скрининг методом гибридизации с антителами позволил выделить 4 полноразмерных клона, экспрессирующих активную люциферазу. Часть библиотеки была трансформирована в плазмиду i, после чего отбор клонов проводили на основе видимого свечения колоний . Для всех 4 люцифераз аминокислотная последовательность содержала 3 аминокислоты. В гг. Анализируя библиотеки кДНК светляков с использованием в качестве зонда кДНК светляков . ДНК длиной около пар оснований, которые кодировали белковые последовательности из 8 аминокислотных остатков. Ген люциферазы светляков i ii был клонирован в году . С использованием мРНК, выделенной из лампочек светляков, была получена библиотека кДНК светляков . X, который затем трансформировали в плазмиду i. Колонии, содержащие ген люциферазы, отбирали по свечению, возникающему при обработке колоний раствором люциферина. К настоящему времени клонированы гены 9 люиифераз светляков и 5 люцифераз жуков табл. Работы по клонированию генов люцифераз позволили за последние лет создать векторы, экспрессирующие каталитически активный фермент в клетках . Впервые каталитически активная рекомбинантная люцифсраза светляков Р. X. В результате экспрессии была получена активная люцифераза, содержащая делецию на конце 9. Для экспрессии люцифсразы . ДНК в векторе X, который затем трансформировали в плазмиду i. Плазмида 4, выделенная из одного из полученных клонов, синтезировала активную люцифсразу . Различные клоны, содержащие кДНК люциферазы, сильно отличались по уровню экспрессии фермента. Было установлено, что уровень экспрессии люциферазы зависит от длины 5,не,гранслируемой области кДНК и от локализации остатка . Для увеличения экспрессии варьировали структуру участка плазмиды i, слитого с геном люциферазы, и локализацию кодона терминации трансляции.