Выделение и свойства эндоглюканаз и ксиланаз Chaetomium cellulolyticum

• Автор: Баразненок, Вера Алексеевна
• Шифр специальности: 02.00.15, 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 147 с.

СОДЕРЖАНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

ГЛАВА 1. ЦЕЛЛЮЛАЗЫ

1.1. Общая характеристика целлюлозы и целлюлолитических ферментов.

1.2.Свойства 1,4рОэндоглюканаз

1.2.1. Биохимические характеристики Г4р0эндоглюканаз из различных источников.

1.2.2. Субстратная специфичность эндо1,4р0глюканаз

1.2.3. Температурные и рНоптимумы, стабильность эндоглюканаз.

к Ш
Нейтральные эндоглюканазы
ГЛАВА 2. КСИЛАНАЗЫ.
1.2.1. Общая характеристика ксиланов и ксиланразрушающих ферментов.
2.2. Свойства эндо1,4р0ксиланаз
2.2.1. Биохимические свойства эндо1,4РОксиланаз.
2.2.2. Субстратная специфичность ксиланаз.
2.2.3. Температурные и рНоптимумы эндоксиланаз и их стабильность.
2.2.4. Действие эндоксиланаз на бумажную пульпу.
Г ЛАВА 3. СЕРИНОВЫЕ ПРОТЕАЗЫ ГРИБОВ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 4 ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА.
4.1. Исходные вещества.
4.1.1. Ферментные препараты.
4.1.2. Субстраты и реактивы.
4.2 Определение активностей ферментов
4.3. Аналитические методы.
4.4 Выделение и очистка индивидуальных ферментов из ферментных препаратов С. сеИиЫуПсит
4.5. Определение биохимических параметров белков
4.6. Определение субстратной специфичности выделенных ферментов для их
. классификации.
4.7 Методы изучения стабильности, температурных и оптимумов ферментов
4.8. Изучение адсорбционной способности ферментов на целлюлозе
4.9. Определение констант Михаэлиса ферментов.
4 Анализ изменения молекулярномассового распределения ММР ксилана березы при его гидролизе ксиланазами С.сеИиЫуИсит и препарата Есори1р ТХ 0
4 Анализ состава продуктов ферментативного гидролиза ксиланов березы и
овса, КМЦ и МКЦ
4 Оценка способности ксиланаз к биоотбеливанию целлюлозной пульпы.
4 Определение консервативного участка аминокислотной последовательности ксиланазы с массой кДа С. сеИиЫуПсит.
4 Анализ ингибирования протеазы С. сеИиЫуПсит.
4 Протеолиз гомогенных белков ферментного комплекса С. сеИиЫуПсит под действием протеазы с массой кДа из того же источника.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
ГЛАВА 5. СВОЙСТВА ЦЕЛЛЮЛАЗНОГО КОМПЛЕКСА СИаеЮтшт
сеИи1о1уИсит
5.1. Активность ферментных комплексов различных штаммов С сеИиЫуПсит по отношению к разным субстратам. и температурные оптимумы
5.2. Влияние различных факторов на стабильность целлюлазного комплекса
С. сеиоусит.
5.3. Адсорбционная способность цсллюлаз ферментного комплекса С. сеиоугсит. . ГЛАВА 6. ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА ИНДИВИДУАЛЬНЫХ КОМПОНЕНТОВ ФЕРМЕНТНОЙ СИСТЕМЫ С. сеиоШсит.
6.1. Фракции 1, 2 и 3 после ионообменной хроматографии ферментного препарата
С. сеиоуНсит на ЭЕАЕТоуореаг.
6.2. Выделение индивидуальных ферментов С. сеиоусит из фракции 1,
полученной в результате ионообменной хроматографии на ОЕАЕТоуореаг
ГЛАВА 7. СПЕЦИФИЧНОСТЬ ГОМОГЕННЫХ КОМПОНЕНТОВ
ФЕРМЕНТНОГО КОМПЛЕКСА С. сеШоусит.
ГЛАВА 8. СВОЙСТВА ЭНДОГЛЮКАНАЗ С МАССАМИ И кДа С.
сеиоусит
ГЛАВА 9. СВОЙСТВА КСИЛАНАЗ С МАССАМИ , И кДа ИЗ С.
сеиоусит
ГЛАВА . ДЕЙСТВИЕ КСИЛАНАЗ С. сеиоусит НА ЭВКАЛИПТОВУЮ
ПУЛЬПУИЗ
ГЛАВА . ЩЕЛОЧНАЯ ПРОТЕАЗА ФЕРМЕНТНОГО КОМПЛЕКСА С. сеиоуНсит.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Макромолекулы в микрофибрилах образуют однородные высокоупорядоченные кристаллические зоны, которые чередуются с неоднородными, менее упорядоченными аморфными зонами . В зависимости от источника и от способа предварительной обработки степень кристалличности целлюлозы может варьироваться от 0 для аморфной целлюлозы полученной набуханием в растворе кислоты до 0 для целлюлозы выделенной из УЫоша тасгоркут 3. Целлюлоза хлопка обладает степенью кристалличности около , а большинство коммерческих препаратов целлюлозы от до 4. Гетерогенность структуры целлюлозы, наличие кристаллических и аморфных областей, существование различных кристаллических модификаций природной целлюлозы объясняет, почему микроорганизмами потребляющими целлюлозу синтезируются многочисленные формы целлюлаз эндо и экзодействия, различающиеся специфичностью к различным видам целлюлозы и ее производным. Коммерческая очищенная целлюлоза выпускается в нескольких формах хлопок, филь гро вальная бумага, Аус микрокристаллическая целлюлоза 1, 3. Эти субстраты используются для оценки общей целлюлолитической активности мультиферментных целлюлазных систем, однако, их физическая гетерогенность степень кристалличности, доступная площадь поверхности, размер пор осложняет более детальные энзимологические исследования. Более того, их использование может неадекватно отражать активность неполных ферментных систем или индивидуальных компонентов, которые могут очень в незначительной степени взаимодействовать с данными субстратами. Это, например, характерно для многих эндоглюканаз 7. Для характеристики целлюлаз часто используются аморфные формы целлюлозы или растворимая карбоксиметил целлюлоза КМЦ благодаря высоким скоростям их ферментативного гидролиза. Однако, необходимо учитывать, что в случае КМЦ, увеличение степени замещения субстрата приводит к уменьшению скоростей гидролиза и к, следовательно, быстрому отклонению кинетики процесса от линейности в ходе реакции 1, 7. Кроме того, наличие боковых заместителей препятствует атаке субстрата многими ферментами экзодействия 1,7. Для исследования свойств целлюлаз используются также различные низкомолекулярные субстраты. Растворимые олигосахариды, состоящие из глюкозных остатков, получаются в результате неполного гидролиза целлюлозы 8. Наиболее часто применяются производные метилумбеллиферона или нитрофенола. Эти субстраты используются для исследования специфичности фермента, а также для определения размера его активного центра и расположения области расщепления субстрата . В зависимости от целей исследования действие ферментов на целлюлозу может быть оценено по ряду различных параметров. О каталитической активности обычно судят по скорости образования растворимых восстанавливающих сахаров 1,. Реже определяется остаточное количество нерастворимой целлюлозы гравиметрически , колориметрически , турбидиметрически . Для исследования морфологических изменений в структуре целлюлозных микрофибрилл используется метод электронной микроскопии . Одним из важных показателей качества ткани после ферментативной обработки является предел прочности на разрыв . Для оценки цветовых характеристик поверхности ткани или бумаги исследуется отражение от нее световых волн определенной длины . Целлюлолитические ферменты относятся к классу карбогидраз 0глюкозидгидролазы, КФ 3. Огликозидной связи. Они играют важную биологическую роль и найдены у многих животных, растений, микроорганизмов ,. Из целлюлолитических ферментов известны эндоглюканазы МрОглюканглюканогидролазы КФ 3. КФ 3. КФ 3. Оглюкозид глюкогидролазы КФ 3. В то же время из одного и того же источника можно получить несколько форм фермента одного типа действия, различающихся по молекулярной массе, изоэлектрической точке, адсорбционной способности на субстрате, термостабильности и по другим свойствам 1, 6. Часто это обусловлено различным гликозилированием ферментов или их частичным протеолизом 1, , . Гидролитической стадии предшествует стадия адсорбции ферментов на поверхности нерастворимого субстрата , , .