Ферроцены как металлоорганические субстраты пероксидазы : Механизм окисления, энантиоселективность, реконструкция активного центра

• Автор: Гораль, Василий Николаевич
• Шифр специальности: 02.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1998
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 139 с. : ил.

Введение

Литературный обзор

Обшие физикохимические свойства пероксидазы из корней хрена

1.1 Изоферментный состав пероксидазы

1.2 Аминокислотный состав

1.3 Углеводный состав

1.4 Сравнение каталитической активности различных нзоферментов

2 Физикохимнчсскнс свойства окисленных форм пероксидазы

соединения I и соединения II

2.1 Строение соединения I

2.2 Образование соединения I

2.3 Реакции соединения I
2 4 Строение соединения II и его реакционная способность
2.5 Окислительновосстановительные потенциалы соединений I и II
3 Феррофермент
4 Кинетика пероксидазного цикла
4.1 Псроксндазнын цикл однозлектронного окисления
4.2 Пероксндазный цикл двухэлектронного окисления
5 Функциональная важность отдельных компонентов пероксидазы
для катализа
5.1 Роль ионов Са1 в пероксидазном катализе
5.2 i
5.3 Туг5 и 3
5 4 i0
5.5
6 Инактивация пероксидазы пероксидом водорода
7 Нетрадиционные субсграты пероксидазы
7.1 Неорганические и металлоорганнчсскис вещества потенциальные
субстраты пероксидазы для создания биосенсоров
7 2 Субстраты в реакции усиленной хемилюминисцснцин
Результаты и их обсуждение
8 Исследование реакции окисления ферроценов пероксидом водорода, катализируемой пероксидазой
8.1 Определение стехиометрии реакции окисления ферроценов пероксидом водорода, катализируемой пероксидазой
8.2 Инактивация пероксидазы под действием Н1О1 в реакции окисления ферроцена и его производных
9 Стационарная кинетика катализируемого пероксидазой окисления ферроцена и его производных под действием НО
9 I Определение кинетического порядка реакции окисления ферроценов, катализируемой пероксидазой 9 2 Влияние поверхностно активных вешеств на кинетику окисления ферроценов 9 3 Эффект поверхностного заряда мицелл на кинетику ферментативного окисления ферроценов
9 4 Обсуждение механизма пероксидазного окисления ферроценов
9.5 Определение константы скорости самообмена
для пары ПХ ПХ
Реакционная способность сединснин 1 и II пероксидазы по отношению ферроценам
1 Изучение взаимопревращений различных форм пероксидазы под
действием ферроценов
.2 Кинетика окисления ферроценкарбоновой кислоты и диметиламинометилферроиена соединениями 1 и II
.3 Кинетика катализируемого пероксидазой окисления ферроценкарбоновой кислоты и диметиламинометилферроиена в стационарных условиях
.4 Сравнениие реакционной способности ферроценов с другими субстратами пероксидазы
.5 Влияние термодинамических и стсричсскнх факторов на скорость
пероксидазного катализа окисления ферроценов
Энантиоселектнвное окисление ферроценов, катализируемое
пероксидазой
Пероксидаза из корней хрена с моднфицированым гемином
в активном центре
.1 Синтез конъюгата ферроценгемни
2 Реконструирование апоПХ с модифицированным
гемин хлоридом
.3 Электрохимические свойства ИсПХ и РсгПХ
4 Каталитическая активность реконструированной нероксидазы
.5 Структурное модслировванис строения РсПХ
6 Анализ возросшей реакционной способности модифицированного
фермента по отношению к искусственным субстратам
Экспериментальная часть
Материалы
1 Реагенты
.2 Приготовление растворов
Методы
1 Кинетические и спектрофотометрические измерения
2 Определение стехиометрии реакции окисления ферроценов
пероксидом водорода, катализируемой пероксидазой
3 Исследование связывания ферроценов с мицеллами ПАВ
.4 Изучение реакционной способности соединения I и соединения II
по отношению к ферроценам
4 1 Приготовление растворов субстратов и соединений 1 и
4 2 Проведение кинегичесикх измерений методом
остановленной струн
4.3 Кинетические измерения в условиях
стационарной кинетики ИЗ
.5 Энантиоселективный катализ пероксидазой окисления планарно
хиральных ферроценов
.6 Создание реконструированной пероксидазы
6 1 Приготовление коньюгатов
.6.2 Встраивание модифицированного гемина
в апоперокендазу
6.3 Экстрагирование модифицированного гемина из
реконструированной псроксидазы
.6.4 Изучение кинетики реакций окисления катализируемых модифицированным ферментом
.6.5 Моделирование структуры ПХ
Выводы
Список литературы


Поэтому целью данной работы явилось изучение механизма и реакционной способности ферроценов в реакциях окисления катализируемых иероксидазой из корней хрена. Изоферментный состав пероксидазы В настоящее время существует очень большое количество литературы посвященной изоферментному составу пероксидазы из корней хрена . В некоторых работах сообщается о существовании до изоферментов пероксидазы из корней хрена 5. На сегодняшний день известно семь основных изоферментов пероксидазы из корней хрена 6. Очень часто вновь открытые новые изоферменгы пероксидазы предстатяют собой те или иные разновидности основных семи изоферментов с различным углеводным составом и различной его ориентацией. Согласно общепринятой классификации зто изоферменты А1, А2, А3. В. С. О и Е. Наиболее широкое применение в различных исследованиях нашли только три основных изофермента А, В и С. Взаимопревращений между изоферментами не наблюдается. Гомогенность семи основных изоферментов проверялась при помощи электрофореза в полиакриламидном диске. Каждый изофермент мигрирует в виде одной полосы с характерной электрофоретической подвижностью табл. I. Седиментационный анализ изоферментов А1, А2, А3, В и С указывает на то, что молекулярные массы изоферментов приблизительно одинаковы. Таблица 1. А1 . А2 2 . А3 5 . В 2. С 3. Г 4 5. Е 6 5. Таким образом, вес изоферменты пероксидазы можно разделить на две группы кислые А1, А2 и А3 и щелочные В. С, О и Е. Ниже будет показано, что различие в физикохимических свойствах внутри каждой из групп очень мало, но велико между кислыми и щелочными формами. Аминокислотный состав изоферментов А1. А2 и А3 очень сходен тоже можно сказать и об аминокислотном составе изоферментов В и С табл. Однако, аминокислотный состав изоферментов А1, Л2 и А3 существенно отличается от аминокислотного состава изоферментов В и С. Количество треонина, серина, глицина и аланина в изоферментах А1, А2 и А3 заметно выше, чем в изоферментах В и С, в то время как фракции В и С намного богаче аргинином, метинином, тирозином и фенилаланином. Аминокислоты, идентифицированные как гидроксипролин, были обнаружены в изоферментах АI, А2, А3, но не были обнаружении в изоферментах В и С. Табл. Аминокислотный состав изоферментов пероксидазы из корней хрена. Лизин 1. Гистидин 1. Аргинин 3. Аспаргиновая кислота . Треонин . Серии . Глутаминовая кислота 7. Пролин 3. Глицин 3. Аланин . Валян 5. Метионин 0. Изолейцин 4. Лейцин 9. Тирозин 0. Фенилаланин 7. Гидроксилролии 0. Изофсрмент С пероксидазы из корней хрена состоит из 8 аминокислотных остатков. Иконец цепи блокирован пиролиденовой кислотой В состав Сконца белка входит лабильный аминокислотный остаток серина. Анализ аминокислотных последовательностей различных изоферментов пероксидазы указывает на их большое сходство между собой. Наибольшая гомология проявляется в сайтах координации гема в дистальной остатки 5 и проксимальной остатки областях. Консервативные аминокислотные последовательности дистальной и проксимальной области гемина представлены в таблице 3. Таблица 3. РИС1 изофермент пероксидазы арахиса, СЬС пероксидаза огурца, ТОР1 анионная пероксидаза табака. ТОР1 Я ЬII Е Н И С Е V V А I. О А Н Т Е С,
1. Углеводы были обнаружены во всех семи изоферментах. Углеводный анализ показывает, что нейтральные и аминосахара составляют до веса фермента. Качественный состав углеводов в изоферментах А1. А2 и А3 одинаков, также, как и в случае изоферментов В и С табл. Сравнение углеводного состава фракций А1. А2 и А3 с углеводным составом изоферментов В и С указывает на их существенное различие. Например, галактоза и арабиноза были обнаружены только в нзоферментах А1, А2 и А3, в то время как ксилоза, фукоза и галактозоамнн присутствуют только в нзоферментах В и С. Таблица 4. Углеводный состав изоферментов перокендазы. Свободный . Аминосахара 1. Л а 2. Данные отсутствуют. Наличие или отсутствие данного сахара н молекуле изофермента. Остановимся теперь более подробно на углеводном составе наиболее широко используемого изофермента С пероксидазы из корней хрена. Он является гликопротеином, содержащим . Ху1. Молекула пероксидазы содержит 8 олигосахаридных цепей.