Свойства ксиланаз, β-глюканаз и ксилоглюканаз Aspergillus japonicus

• Автор: Гришутин, Сергей Геннадьевич
• Шифр специальности: 02.00.15, 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 177 с. : ил.

Содержание

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Современные представления о классификации карбогидраз

1.2. Структура и функции ксилоглюкана клеточных стенок растений.

1.3. Ферменты гидролизующие ксилоглюкан

1.4. Структура и функции нецеллюлозных глкжанов

1.5. Ферменты гидролизующие глюканы

1.6. Ферменты i

Н. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 2. Объекты исследования и методика эксперимента
2.1. Использованные вещества.
2.2. Хроматографическое фракционирование и очистка ферментов.
2.2.1. Разделение препарата .i
2.2.2. Хроматографический анализ препаратов .i
2.2.3. Разделение препарата .i.
2.3. Определение ферментативной активности и белка.
2.4. Определение биохимических характеристик ферментов.
ф, 2.5. Определение зависимости активности ферментов
2.6. Изучение термостабильности ферментов
2.7. Определение кинетических параметров действия ферментов
2.8. Проведение гидролиза глюкана, ксилоглюкана и арабиноксилана под действием ферментов
2.9. Исследование изменения молекулярномассового распределения полисахаридов
2 Исследование состава низкомолекулярньтх продуктов гидролиза полисахаридов
2 Определение вискозимсгрической активности по глюкану и карбоксиметилцеллюлозе с одновременным определением выхода ВС
2 Масс спектрометрический анализ пептидного фингерпринта выделенных
белков.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
Г лава 3. Выделение и очистка фермситов .i
3.1. Фракционирование исходного препарата .i с помощью ионообменной хроматографии на
3.2. Очистка глюканазы кДа и ксиланазы кДа.
3.3. Очистка ксиланазы кДа с помощью гидрофобной хроматографии на .
ЗА Очистка ксилоглюканазы кДа с помощью ионообменной хроматографии на
.
3.5. Очистка арабиноксиланарабинофурангидролазы кДа
Глава 4. Идентификация выделенных ферментов с помощью протеолиза
трипсином с последующей массспектрометрией пептидов
Глава 5. Изучение свойств выделенных ферментов .i
5.1. Активность и кинетические параметры действия ферментов на различные субстраты.
5.2. зависимости и термостабильность ферментов.
5.3. Механизм гидролиза рглюкана под действием рглюканаз, эндоглюканаз и экзорглкжозидазы
5.3.1. Изучение продуктов гидролиза с помощью ГПХ
5.3.2. Изучение продуктов исчерпывающего гидролиза рглюкана.
5.3.3. Сравнение продуктов исчерпывающего гидролиза рглюкана .i и лихеиазой В. ii.
5.3.4. Изучение начальной стадии гидролиза рглюкана с помощью вискозиметрии
5.4. Механизм гидролиза ксилоглюкана под действием ксилоглюканаз и эндоглюканаз
5.4.1. Изучение продуктов гидролиза ксилоглюкана с помощью ГПХ.
ф 5.4.2. Изучение продуктов исчерпывающего гидролиза ксилоглюкана.
Глава 6. Анализ качественного и количественного состава ферментных препаратов .i
6.1. Характеристики исходных препаратов.
6.2. Хроматографическое разделение и определение активности фракций
6.3. Анализ состава и содержания ферментов в препаратах.
6.3.1. Идентификация известных ферментов .i.
6.3.2. Оценка количественного содержалия индивидуальных ферментов.
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Как правило, их ксилоглюкан не содержит фукозильных заместителей, содержит меньше ксилозы и много меньше галактозы . Гидролиз эндоглюканазой разных образцов ксилоглюканов, в том числе ячменя, риса, бамбука, давал в основном пентасахарид X, и глюкозу, а также меньшие количества гексасахарида X, , трисахарида X, и целлобиозы. Авторы предполагают, что первоначально, эти ксилоглюканы содержали больше ксилозильных и галактозилксилозильных заместителей, которые были удалены в процессе роста, благодаря ирисуствуюшим а ксилозидазпой и 3 галактозидазной активностям. Показано, что некоторые однодольные, например i сера и лук, содержат ксилоглюканы очень похожие на ксилоглюканы двудольных. В последенее время накоплены данные, свидетельствующие, что ксилоглюканы растений семейства пасленовых наиболее изучены ксилоглюканы картофеля, томата и табака отличаются от наиболее распространенного ксилоглтокана XXX типа. Основным структурным мотивом ксилоглюкана пасленовых является блок XXтина . Другой их особенностью является высокое содержание арабииозы, потому их иногда называют арабиноксилоглюканами. До остатков ксилозы в таких ксилоглюканах несут заместитель арабинозу в положении 2VX1 . Такой сегмент ксилоглюкана обозначается буквой . В настоящее время продолжают находить новые структурные фрагменты ксилоглюканов. Так, недавно в ксилоглюкане из листьев дерева i i охарактеризована серия олигосахаридов, содержащих два остатка ксилозы в боковой цепи фрагмент 3Xv Xv6 обозначаемый буквой . Отмечается, что ксилоглюканы из ююточных стенок могут быть Оацетилированы так же, как другие полисахариды, например, пектины или ксиланы. В работе на внекленочном ксилоглюкане явора установлено, что ацетилированы в основном галактозильные остатки повторяющегося звена нонасахарида. Были найдены моно и диацетилъные производные, ацетилирование наблюдали в положениях Об, и в соотношении , , соответственно. Конформация молекулы ксилоглюкана. В результате изучения ксилоглюкана гороха методом рентгеновского рассеяния, а также моделирования структу ры и расчета энергии, предложена вероятная конформация молекул ксилоглюкана . Конформация основной цепи из р связанной глюкозы фиксирована водородными связями и представляет собой ленту, где каждое звено повернуто на 0 относительно предыдущего, как и в целлюлозе. В то же время, ксилозильные заместители имеют высокую степень подвижности. Заместители, идущие друг за другом, находятся по разные стороны ленты в результате поворотов звеньев основной цепи рис. Показано также, что ксилозильные, галактозильные и фукозильные остатки не влияют на конформацию основной цепи. Предполагается, что ксилогшоканы из других источников имеют такую же конформацию. Рис. Конформация молекулы ксилоглюкана гороха. Р1,4глюкана, 2 проекция перпендикулярно плоскости цепи ,4глюкана. Атомы водорода не показаны, штриховой линией показаны водородные связи модель из . Функция ксилоглюкана в клеточных стенках. В существующих моделях клеточной стенки растений ксилоглюкан играет важную роль компонента, связывающего микрофибриллы целлюлозы в единую сеть, обеспечивающую механическую прочность. Кроме того, считается, что возможность удлинения клеточных стенок в большой степени связана с контролируемым расщеплением и сшиванием молекул ксилоглюкана, что позволяет микрофибриллам целлюлозы скользить друг относительно друга , . Модель связывания микрофибрилл целлюлозы с ксилоглюканом в клеточной стенке растения приведена на рис. Данная модель объясняет существование грех основных фракций ксилоглюкана в клеточной стенке той, которая может быть солюбилизирована под действием фермента свободные цепи, той, которая может быть солюбилизирована только под действием КОН сорбированный на микрофибриллах, и той, которая остается связанной с целлюлозой даже после обработки КОН включенный в микрофибриллы . Рис. Связывание ксилоглюкана и микрофибрилл целлюлозы в единую сеть в клеточных стенках растений из работы . Кроме структурной функции ксилоглюканов, их фрагменты играют и другую роль.