Изучение биоспецифических взаимодействий методом проточного хемилюминесцентного анализа

• Автор: Зайцева, Наталья Вячеславовна
• Шифр специальности: 02.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 128 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Г ЛАВА 1. Прогочиоинжекционные методы иммуноанализа

1.1. Конкурентные методы

1.2. Неконкурентные методы

1.3. Метод вытеснения

Г ЛАВА 2. Иммунобиосенсоры

2.1. Электрохимические иммуносенсоры

2.1.1. Иммуноферментные сенсоры

2.1.2. Иммуносенсоры, основанные на детекции неферментативной метки
2.1.3. Прямая детекция иммуновзаимодействия в отсутствии метки
2.2. Пьезоэлектрические иммуносенсоры
2.3. Оптические методы изучения иммунореакций на поверхностях
ГЛАВА 3. Реакция усиленной хемилюминесценции
3.1. Механизм реакции 3
3.2. Использование реакции усиленной хемилюминесценции для аналитических целей
ГЛАВА 4. Хсмилюминссцентный иммуноанализ
4.1. Хемилюминесцентный иммуносубстратный анализ
4.2. Хемилюминесцентный иммуноферментный анализ
ГЛАВА 5. Материалы и методы
5.1. Материалы и оборудование
5.2. Методы исследования
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
ГЛАВА 6. Проточный анализ с использованием реакции усиленной хемилюминесценции и пероксидазы хрена для мониторинга воды ГЛАВА 7. Изучение физикохимических закономерностей взаимодействия антигенантитело в тонкослойной проточной системе
7.1. Изучение сорбции меченных пероксидазой антител на полистирольной поверхности в статическом и проточном режимах
7.2. Определение кинетических и равновесных констант реакции комплсксообразования антигенантитело
7.3. Определение кинетических параметров реакции
комплексообразования антигенантитело в случае ковалентной фотоиммобилизации антител на поверхности мембраны
ГЛАВА 8. Разработка методов тонкослойного проточного
иммуноферментного анализа антигенов симазина и 2,4дихлорфеноксиуксусной кислоты
8.1. Определение симазина
8.2. Определение 2,4дихлорфеноксиуксусной кислоты
ГЛАВА 9. Разработка проточного иммуноферментного анализа в режиме реального времени
9.1. Общие принципы
9.2. Определение 2,4дихлорфеноксиуксусной кислоты и симазина в режиме реального времени
9.3. Изучение кинетических закономерностей процессов комплексообразования антигенантигело в режиме реального времени
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Перемешивание, происходящее в результате радиальной диффузии, практически не приводит к заметной дисперсии продольному размыванию образца в потоке носителя, что достигается использованием тонких капиллярных соединительных трубок и постоянством скорости движения жидкости 3. Реагенты, необходимые для проведения аналитических операций, могут содержаться в потоке или их иммобилизуют на омываемых потоком поверхностях. Регулируя длину, диаметр и форму соединительных трубок, а также скорость потока, можно добиться оптимального для данного теста диспергирования образца и уменьшения времени анализа, а также расхода инжектируемого образца и используемых реагентов. Кроме того, при работе с автоматическими пробоотборниками и управлении системой с помощью микропроцессоров анализ можно полностью автоматизировать. Еще около десяти лет назад в обзорах по проточным системам упоминалось о том, что твердофазные реакторы, содержащие иммобилизованные иммунохимические компоненты, относительно мало изучены применительно к I. Однако в последние несколько лет наблюдается существенный прогресс в области разработки твердофазных проточноинжекционных методов иммуноанализа. На сегодняшний день предложено много разнообразных вариантов и схем проведения данного анализа. Наиболее распространенными из них являются методы конкурентный, неконкурентный и вытеснения. Принцип конкурентного иммуноанализа состоит в одновременном добавлении к иммобилизованным антителам определяемого и меченого антигена, которые конкурируют за связывание с антителами, и последующего измерения ферментной метки в комплексе с антителами или в несвязанном меченом антигене. Необходимым условием конкурентного метода является недостаток центров специфического связывания по отношению к суммарной концентрации анализируемого и меченого соединения, так как в противном случае каждый из процессов образования иммунокомплексов может происходить независимо от другого и, следовательно, определяемая экспериментально концентрация метки не будет зависеть от концентрации анализируемого соединения в растворе. Система включала колонку с иммобилизованным белком А. Так как белок А обладает высокой аффинностью по отношению к иммуноглобулинам, колонку насыщали антителами против теофиллина. Затем инжектировали смесь свободного и меченного щелочной фосфатазой теофиллина, которые конкурировали за связывание с иммобилизованными антителами. Количество меченого антигена, провзаимодействовавшего с антителами, было обратно пропорционально концентрации свободного гаптена. После иммунореакции инжектировали раствор субстрата, содержащий паминофенилфосфат, который под действием щелочной фосфатазы превращался в паминофенол, последний детектировали амперометрически. Регенерацию иммуносорбента осуществляли пропусканием раствора кислоты и последующим насыщением колонки антителами против теофиллина. Еще в ряде работ сообщается о разработке твердофазного проточноинжекционного конкурентного иммуноанализа для теофиллина 5, 6. Схемы анализа были аналогичны используемой в предыдущей работе, за исключением способа детекции комплексов антигенантитело, в качестве метки использовали флуоресцсин изотиоцианат. Предел обнаружения антигена составил величину порядка 0,3 нгмл. Конкурентную схему использовали в работе 7 для определения противосудорожного средства фенитоииа. Для разделения свободного и связанного в иммунокомплекс антигена использовали колонку с гидрофобным носителем, способным задерживать определяемый образец, не связанный в иммунокомплекс. Фенитоин и меченный флуоресцеином фенитоин инкубировали в растворе со специфическими антителами. Свободный антиген и трсйсер конкурировали в растворе за ограниченное число антигенсвязывающих центров антител. Затем реакционную смссь пропускали через колонку, где задерживались не связанные в комплекс трсйсер и аналит, на выходе из колонки детектировали комплексы антител с меченым фенитоином. Материал колонки имел различную активную поверхность, состоящую из полистирола, радикалов окгадецила, пропионитрила, бутила. Предел обнаружения антигена в сыворотке крови составил 5 нМ.