Свойства мутантов пенициллинацилазы из Escherichia coli по положению 145 и 149 альфа субъединицы, 71, 384, 385 бета субъединицы в реакциях ацилирования аминосоединений и стереоселективного гидролиза амидов

• Автор: Ямскова, Ольга Васильевна
• Шифр специальности: 02.00.15, 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 111 с. : ил.

Введение

1. Обзор литературы

1. 1. Общие сведения о пенициллинацилазе из . i

1. 2. Методы определения ферментативной активности пенициллинацилазы

1. 3. Очистка пенициллинацилазы

1.3. 1. Источники пенициллинацилазы и способы е первичного выделения

1.3.2. Очистка пенициллинацилазы

1. 4. Применение ПА из .i для получения энантиомерно чистых соединений

1. 5. Применение ПА из .i в реакциях ферментативного ацильного переноса

1. 6. Изменение каталитических свойств ПА при помощи мутагенеза

. 2. Экспериментальная часть

2. 1. Материалы
2. 2. Методы
2. 2. 1. Культивирование клеток, содержащих пснициллинацилазу и е , мутантные формы
2. 2. 2. Выделение пенициллинацилазы и е мутантных форм методом осмотического шока
2. 2. 3. Очистка пенициллинацилазы и е мутантных форм при помощи гидрофобной хроматографии
2. 2. 4. Определение активности пенициллинацилазы и с мутантных форм
2. 2. 5. Определение концентрации активных центров пенициллинацилазы и е мутантных форм
2. 2. 6. Исследование термостабильности пенициллинацилазы и сс мутантных форм
2. 2. 7. Исследование рНстабилыюсти пенициллинацилазы и е мутантш,тх
2. 2. 8. Количественное определение компонентов реакционной смеси методом высокоэффективной жидкостной хроматографии 2. 2. 9. Определение энантиомеров первичных аминосоединений методом предколоночной дериватизации ортофталевым альдегидом 2. 2. . Определение энантиоселективиости реакции ферментативного гидролиза Ыфенил ацетильных производных аминокислот, аминов и аминоспиртов 2. 2. . Определение энантиоселективиости реакции ферментативного гидролиза МК.манделилпроизводных аминосоединений 2. 2. . Химический синтез Ыфенилацечильных производных аминосоединений 2. 2. . Определение кинетических параметров ферментативного ацильного переноса на 6аминопенициллановую кислоту
2. 2. . Определение соотношения скоростей синтезагидролиза и максимального выхода цлевого продукта в реакции ферментативного синтеза ампициллина
2. 2. . Исследование кинетики ферментативного ацилироваиия аминосоединений Я и 8амидом миндальной кислоты
2. 2. . Исследование кинетики ферментативного ацилироваиия первичного аминосоедииения амидом Яминдалыюн кислоты
2. 2. . Исследование кинетических параметров ацильного переноса,
катализируемого мутантными формами пенициллинацилазы, на Бэнантиомеры аминосоединений с использованием фенилацетамида в качестве ацильного донора и определение максимального выхода целевого продукта
3. Обсуждение результатов
3. 1. Очистка рекомбинантных пешщиллинацилаз
3. 2. Каталитическая активность мутантных форм пенициллинацилазы
3. 3. Стабильность мутантных форм
3. 4. Мутантные формы пенициллинацилазы в реакции гидролиза Мацильньтх производных аминосоединений
3. 4. 1. Ферментативный гидролиз 4феннлацетильного производного аспарагиновой кислоты
3. 4. 2. Ферментативный гидролиз Ыацильных производных первичных аминов и аминоспиртов
3. 5. Мутантные формы пенициллинацилазы как катализаторы реакции ацильного переноса
3. 5. 1. Влияние введения мутаций на эффективность ферментативного синтеза ампициллина
3. 5. 2. Использование мутантной формы Лгй5Ьеи и рРЬеВеи в качестве
катализатора ацилирования аминосоединсний в водной среде
4. Выводы
5. Список литературы
ЧИн .
Список сокращений
ПА пенициллинацилаза
6АПК 6аминопенициллановая кислота
ФУК фенилуксусная кислота
ФМСФ фенилметилсульфонилфторид
I пнитромкарбоксианилид фенилуксусной кислоты
ФГ фенилглицин
ФГ А амид фснилглицина
ФАА фенилацстамид
ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография
оФА офталевый альдегид
БП бензилпенициллин
амид миндальной кислоты
Ыацстил5цистеин
соотношение начальных скоростей накопления продуктов синтеза и гидролиза
в реакциях ацильного переноса
Е стереоспецифичность
ее энаитиомерный избыток
ПО предел обнаружения
ПКО Предел количественного определения
Введение
Актуальность


На основании анализа научной литературы наиболее эффективным способом улучшения свойств пенициллинацилазы дикого типа представляется введение мутаций в структуру фермента. В случае пенициллинацилазы из ii i ранее было показано, что введением мутаций удается добиться улучшения4 способности фермента катализировать синтез беталактамных антибиотиков. I I. II . Более того, наряду с целью улучшения каталитической эффективности, задачей диссертационной работы было также увеличение стереоселективности действия фермента, принципы регуляции которой в настоящее время практически не изучены. Цель и задачи исследования. Основной задачей настоящей работы явилось изучение мутантных препаратов пенициллинацилазы из Е. И по положению 5, 9 альфа цепи, а также , 4, 5 бета цепи с цслыо поиска форм фермента с увеличенной стереоселективностыо и каталитической эффективностью в реакциях ацнлирования первичных аминов и аминоспиртов, а также в реакциях стереоселективного гидролиза соответствующих Мацильных производных. В соответствии с этим, было необходимо изучить каталитические свойства мугантных препаратов пенициллинацилазы, в частности, получить гомогенные препараты мутантных форм пенициллинацилазы, провести первичную характеристику их стабильности и каталитической активности, детальные исследования каталитических свойств перспективных препаратов в реакциях стереоселекгивного ацильного переноса на первичные амины и аминоегшрты, а также гидролиза соответствующих Мацильных проиводньтх. Обзор литературы 1. Общие сведения о пенициллинацилазе из Е. Пенициллинацилаза ПА относится к классу гидролаз, подклассу амидогидролаз К. Ф.3. Впервые Г1А выделили в х годах из грибов iii и i 1, 2, а в дальнейшем обнаружили у разных микроорганизмов 3, 4, 5, 6, 7, 8. Хотя ПА из разных продуцентов характеризуются достаточно высокой степенью гомологичности 9, они могут достаточно сильно отличаться между собой по каталитическим свойствам , , , . Уникальным свойством ферментов данного семейства является их способность избирательно катализировать расщепление амидной связи пенициллина, не затрагивая более лабильную лактамную связь ядра антибиотика. ПА из . АТСС 5 состоит из а и цепей . Да и . Да, соответственно , которые получаются в результате протеолитической активации общего мембранносвязанного предшественника стереоизображение трехмерной структуры пенициллинацилазы представлено на рис. Рис. Стереоизображение трехмерной структуры пенициллинацилазы асубъединица показана красным цветом, рсубъединица зеленым. Предшественник синтезируется как полипептид кДа, состоящий из сигнального пептида, содержащего аминокислот а. Рсубъединиц 9 а. Обе цепи, из которых состоит пенициллинацилаза, тесно переплетены и формируют пирамидальную структуру с глубокой чашеобразной выемкой в центре, на дне которой находится активный центр фермента. В структуре ПА выделяют 3 участка связывания субстрата участок связывания ацильной части субстрата, участок связывания карбоксильной группы или ес аналога и участок связывания бокового радикала. Из анализа структуры комплекса фермента с фенилуксусной кислотой, являющейся сильным конкурентным ингибитором, следует, что связывание субстрата происходит внутри глубокой выемки в поверхности белковой глобулы, на дне которой находится гидрофобный карман, образованный многочисленными ароматическими боковыми радикалами аминокислот. Фсиильная часть ингибитора направлена внугрь этого кармана, а карбоксильная группа взаимодействует с серином П. Предполагается, что нуклеофильность гидроксильной группы концевого серина i увеличивается за счет взаимодействия с собственной аминогруппой при участии молекулы воды. Предложенный механизм катализа можно описать следующим образом. Атака атома 0 концевого серина по карбонильному атому углерода субстрата сопровождается передачей протона от гидроксильной группы на собственную аминогруппу при участии мостиковой молекулы воды. При этом образуется оксианиоп, который затем предположительно стабилизируется путем взаимодействия с амидной группой Р1 и атомом азота полипептидного остова, принадлежащим рА1а. Аминокислотные остатки 1 и РА1а образуют оксианиоиный центр.