Модификация спектров биолюминесценции и термостабильности люциферазы светляков Luciola mingrelica методами мутагенеза

• Автор: Кокшаров, Михаил Иванович
• Шифр специальности: 02.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 132 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

ПРИНЯТЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Строение люцифераз светляков.

1.1. Механизм биолюминесцентной реакции люциферазы

1.2. Первичные структуры люцифераз жуков

1.3. Пространственная структура и активный центр люциферазы светляков.

2. Спектры биолюминесценции люцифераз

2.1. Особенности спектров биолюминесценции люцифераз жуков.

2.2. Физикохимические представления о влиянии окружения на

спекгры испускания флуорофоров.
2.3. Механизмы изменения спектров биолюминесценции, описанные в литературе
2.4. Связь между структурой и спектрами биолюминесценции шоцифераз.
3. Стабильность люциферазы светляков.
3.1. Факторы, влияющие на стабильность люциферазы светляков
3.2. Повышение термостабильности люцифераз методом мутагенеза
3.3. Повышение устойчивости ферментов к действию органических растворителей методом мутагенеза.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
1. Вещества и реагенты.
2. Шгаммы и плазмиды.
3. Аппаратура
4. Методики проведения экспериментов.
4.1. Выделение и очистка люциферазы
4.2. Изучение свойств люциферазы.
4.3. Методы работы с ДНК.
4.4. Конструирование плазмид.
4.5. Получение мутантной формы люциферазы с заменой С6М, А7И
методом сайтнаправлснного мутагенеза
4.6. Получение мутантных форм люциферазы с измененным спектром биолюминесценции и повышенной устойчивостью к ДМСО методом
случайного мутагенеза.
4.7. Получение мутантных форм люциферазы с повышенной
термостабилыюстыо методом направленной эволюции

4.8. Компьютерное моделирование и анализ структуры люцифсразы . i. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Получение и свойства двойного мутанта .7
1.1. Получение и физикохимические свойства мутанта.
1.2. Спектры биолюминесценции.
1.3. Термостабильность мутанта 6,7
1.4. Обсуждение эффектов замены 6,7.
2. Векторы для получения люциферазы и сравнение свойств различных форм рекомбинантного фермента дикого типа
2.1. Конструирование использованных плазмид.
2.2. Экспрессия генетических конструкций и очистка рекомбинантных ферментов
2.3. Сравнение свойств различных форм рекомбинантной гГлюцпферазы
3. Получение мутантов с измененными спектрами биолюминесценции методом случайного мутагенеза.
3.1. Отбор мутантов с измененным спектром биолюминесценции
3.2. Выделение, каталитические свойства и стабильность мутантов.
3.3. Спектры биолюминесценции мутантов
2.4. Обсуждение эффекта замены на , i
4. Получение мутантов с повышенной устойчивостью к ДМСО.
5. Повышение термостабильности люциферазы методом направленной эволюции
5.1 Случайный мутагенез и скрининг муппггов но термостабильности
5.2 Кинетические свойства и спектры биолюминесценции мутанта 4.
5.3 Термостабильность мутанта 4
5.4 Сравнение свойств мутанта 4 п нативной люциферазы
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


На первой стадии фермент связывается с субстратами люциферином и аденозин5трифосфатом АТФ. В таком тройном фсрментсубстрагном комплексе люциферин ковалентно взаимодействует с АТФ, и в результате образуются смешанный ангидрид карбоновой и фосфорной кислот люцифериладенилат 2 и пирофосфат. Далее люцифернладеннлат через ряд промежуточных стадий окисляется кислородом воздуха, превращаясь в циклический пероксид диокеитанон 3. Затем электронновозбужденный окснлюциферин дезактивируется с излучением кванта света. При оптимальных условиях у лгацифераз светляков, как правило, наблюдается зеленое свечение, но в ряде условий может наблюдаться и испускание красного света . Конкретные молекулярные формы и электронные структуры эмилераоксилюциферина 4, отвечающие излучению красного и зеленого света в бполюминесцентной системе светляков, до сих по является предметом обсуждения ,. К настоящему времени известны более последовательностей люцифераз из различных видов биолюминесцентных жуков, обитающих в США, Южной Америке, Квропе и Азии . Вес люциферазы жуков состоят из одной белковой цепи 22 остатка, и обладают достаточно высокой степенью взаимной гомологии, составляющей не менее для наиболее различающихся последовательностей. Это указывает на их общее эволюционное происхождение и функциональное сходство. Знание первичных структур делает возможным выявить консервативные участки аминокислотной последовательности, отвечающие за одинаковые функции и. На рисунке 2 показано филогенетическое дерево для большинства известных последовательностей люцифераз жуков. Эти люциферазы по степени гомологии разделяются на три большие группы I люциферазы из жуковсветляков ЬатругШа 2 люциферазы из жуков семейств РкепосИЛае и ЮпаорЫка1т1к1е 3 люцифераз,I из жуковщелкунов Е1шепс1ае. Сравнение первичных последовательностей люцифераз показывает, что вторая группа но степени гомологии немного ближе к люциферазам первой группы. Филогенетические исследования эволюции биолюминесцентных жуков показывают, что у жуковщелкунов биолюминесценция возникла независимо , от остальных, а у первой и второй групп могла возникнуть как независимо , так и иметь общее происхождение . Кроме того, биолюминесцентные свойства люцифераз между тремя группами несколько отличаются , что будет более подробно описано в Главе 2. Степень гомологии люцифераз рода 1исю1а со второй и третьей группами составляет и соответственно. Следует отметить, что последовательности люцифераз из нескольких других менее распространенных семейств биолюминесцентных жуков НопгаШкШе, ТеЫетае и др. Филогенетическое дерево для аминокислотных последовательностей люцифераз, выделенных из различных видов жуков. Среди люцифераз светляков можно выделить подгруппу ферментов, наиболее близких по гомологии к люциферазе светляков i ii рис. Следующими наиболее близкими по гомологии являются люциферазы i ii и i i . Большинство остальных люцифераз светляков имеют гомологии с люциферазами рода i. Интересно отметить, что особняком стоит одна из двух люцифераз, выделенных из светляков i vi номер 0 рис. Люцифераза светляков принадлежит к супсрссмсйству адснилатобразующих ферментов, катализирующих аденилирование карбоксильной группы субстрата при использовании АТФ в качестве ЛМФдонора . Она имеет заметное сходство первичной структуры с АТФзависимыми ацилСо Алигазами и нерибосомальными пептидсинтетазами . Несмотря на то, что систематические исследования люциферазы светляков проводились с конца х годов XX века, только в году была получена первая кристаллическая структура этого фермента для люциферазы Р. Ш . Она стала и первой известной структурой аденилатобразующего фермента. Структура была получена для фермента, свободного от субстратов, а известно, что их связывание вызывает значительные конформационные перестройки , и изменяет физикохимические свойства фермента . В г. Р. ругаь в комплексе с двумя молекулами ингибиторабромоформа , которые связываются в той же полости, что и люциферин. Эта структура практически совпадала со структурой свободного фермента. Рис. Структура люциферазы светляков . П18А .