Изучение каталитической активности гетеродимера и индивидуальных субъединиц пенициллинацилазы из E. coli

• Автор: Шамолина, Татьяна Анатольевна
• Шифр специальности: 02.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 101 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Биосинтез и структура пеннциллинацилазы

1.1.1. Источники пенициллинацилаз

1.1.2. Субъединичный состав

1.1.3. Структура гена и экспрессия пеннциллинацилазы

1 . Основные достижения рентгеноструктурного анализа в изучении структуры и механизма действия пеннциллинацилазы

1.2. Каталитические свойства пеннциллинацилазы.

1.3. Роль субъединиц в формировании активного центра пеннциллинацилазы.

1.3.1. Ренатурация гетеродимера пеннциллинацилазы и индивидуальных субъединиц после разделения в денатурирующих условиях
I 3.2. Получение каталитически активной пеннциллинацилазы из отдельно экспрессирован н ых субъеди ниц.
1.3.3. Изучение поведения пеннциллинацилазы в системе обращенных мицелл
1.3.3.1. Краткая характеристика систем обращенных мицелл поверхностно активных веществ в органических растворителях.
1.3.3.2. Каталитические свойства ферментов, солюбилизированных в системах обращенных мицелл.
1.3.3.3. Пенициллинацилаза в системе обращенных мицелл ЛО Г в
2. ПОС ТАНОВКА ЗАДАЧИ.
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
3.1. Материалы.
3.2. Методы.
3.2.1. Измерение скорости ферментативной реакции в буферном растворе.
3.2.2 Измерение скорости ферментативной реакции в системе обращенных мицелл
3.2.3. Определение концентрации активных центров пенициллинацилазы .
3.2.4. Очистка пенициллинацилазы из соИ
3.2.5 Разделение субъединиц пенициллинацилазы в денатурирующих условиях
3.2.6. Ренатурация гетеродимера и субъединиц пенициллинацилазы
3.2.7. Модификация пенициллинацилазы МсукцинимидилЗ
м ал е и м и д обе н зо ато м.
3.2.8. Ингибирование пенициллинацилазы фенилметилсульфонилфторидом в системе обращенных мицелл.
3.2.9. Определение содержания воды в препарате АОТ
3.2 Седиментационный анализ.
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
4.1. Изучение поведения пенициллинацилазы в системе обращенных мицелл АО Г в октане.
4.1.1. Выбор субстрата для изучения каталитических свойств пенициллинацилазы в системе обращенных мицелл.
4.1.2. Определение рНоптимума функционирования пенициллинацилазы в системе обращенных мицелл.
4.1.3. Зависимость каталитической активности пенициллинацилазы от концентрации ПАВ
4.1.4. Зависимость активности пенициллинацилазы от степени гидратации
4.1.5. Зависимость активности пенициллинацилазы от концентрации фермента при низких степенях гидратации обращенных мицелл.
4.1.6. Стабильность пенициллинацилазы в системе обращенных мицелл.
4.1.7. Седиментационный анализ обращенных мицелл, содержащих пенициллинацилазу при различных степенях гидратации.
4.1.8. Модификация пенициллинацилазы бифункциональным сукцинимидил3малеимидобснзоатом МВ5.
4.1.9. Определение концентрации активных центров пенициллинацилазы открываются ли новые активные центры при солюбилизации в системе обращенных мицелл.
4.2. Реактивации гетеродимера и индивидуальных субъединиц пенициллинацилазы после разделения в денатурирующих условиях.
5. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ
6. ЛИТЕРАТУРА
Список сокращений
ЛОТ натриевая соль ди2этилгексилового эфира сульфоянтарной кислоты
сукцишшидилЗмалеимидобензоат
I мкарбоксипнитроанилид фенилуксусной кислоты
II пенициллинацилаза
1I поверхностноактивное вещество
РА А пнитроанилид фенилуксусной кислоты
додецилсульфат натрия
ФУК фенилуксусная кислота
ФМСФ фенилметилсульфонилфторид.
ВВЕДЕНИЕ


Стабильность пенициллинацилазы в системе обращенных мицелл. Седиментационный анализ обращенных мицелл, содержащих пенициллинацилазу при различных степенях гидратации. Модификация пенициллинацилазы бифункциональным сукцинимидил3малеимидобснзоатом МВ5. Определение концентрации активных центров пенициллинацилазы открываются ли новые активные центры при солюбилизации в системе обращенных мицелл. Реактивации гетеродимера и индивидуальных субъединиц пенициллинацилазы после разделения в денатурирующих условиях. ФМСФ фенилметилсульфонилфторид. Пенгадаллинацилаза КФ 3. Однако, этот фермент обладает существенно более широкой, чем представлялось ранее, субстратной специфичностью и может быть эффективно использован для решения задач тонкого органического синтеза 3, 4. Биосинтез фермента и механизм его действия явились предметом активных исследований в последнее десятилетие , но, несмотря на это, в настоящее время в литературе нет единого мнения по поводу механизма катализа и, в частности, роли субъединиц в формировании каталитически активной формы фермента. Еще в году был разработан метод титрования активных центров пснициллинацилазы при помощи необратимого ингибитора фенилметилсульфонилфторида, эффективно инактивирующего фермент в эквимолярном соотношении 8. Данные рентгеноструктурного анализа пенициллинацилазы из К. И АТСС 5, также свидетельствуют о том, что гстеродимер пенициллинацилазы имеет один активный центр, сформированный при участии обеих субъединиц 6. Был предложен принципиально новый механизм катализа и предположено, что активация нуклеофила в единственном активном центре гетеродимера осуществляется собственной ааминогруппой Ыконцевого серина рсубъединицы с участием молекулы воды 6. Однако, сгройносгь сформировавшихся представлений о наличии одного активного цегпра в гетеродимере пенициллинацилазы была поставлена под сомнение работами по исследованию поведения пенициллинацилазы в системе обращенных мицелл ЛОТ в октане 9, , в которых было высказано предположение о существоватгии дополнительного активного центра, проявляющего каталитические свойства при мягкой диссоциации гетеродимера пснициллинацилазы на субъединицы в условиях обращенных мицелл. В этой работе проведено подробное исследование поведения пенициллинацилазы из . ЛОТ в октане и показано, что молекула пенициллинацилазы представляет собой прочный гетеродимер, не способный к диссоциации в системе обращенных мицелл. Отдельная глава посвящена получению индивидуальных субъединиц пенициллинацилазы методом гельфильтрации в денатурирующих условиях, в которой показано, что активностью обладает только гетеродимер фермента, а субъединицы в отдельности активности не проявляют. Впервые ацилазная активность была описана японскими учеными i К. Они обнаружили, что клетки iii 6 способны превращать бензил пенициллин в фенилуксусную кис лозу и соединение, которое они назвали пеницип . Позднее они показали , что пеницин есть не что иное, как 6аминопенициллановая кислота 6АПК. Однако, долгое время это мнение считалось ошибочным. Несмотря на то, что в году независимо в нескольких лабораториях было продемонстрировано наличие ацилазной активности в различных микроорганизмах , подтвердить данные, полученные i и для . Лишь в году i и , а также и ii продемонстрировали, что этот штамм действительно способен гидролизовать бензилпснициллин с образованием 6II. К началу х годов сформировалось представление о существовании двух основных типов ацилаз. Изза отсутствия информации о структуре ферментов, основой классификации ацилаз стали их источники и наиболее быстро гидролизуемые субстраты. Главной характеристикой первого типа ацилаз являлась способность гидролизовать феноксиметилпенициллин пенициллин V значительно быстрее, чем бензилпенициллин пенициллин . Все описанные ацилазы первого типа были выделены, в основном, из дрожжей, грибов или плесеней i, i, ii, i, , ii, i, i, i, , iii, , i, i и i . Ко второму типу отнесли ацилазы, способные гидролизовать бензилпснициллин быстрее, чем феноксиметилпенициллин.