Кинетические закономерности инактивации и стабилизация ферментов бактериофагов, специфичных к грам-положительным микроорганизмам

• Автор: Филатова, Любовь Юрьевна
• Шифр специальности: 02.00.15, 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 162 с. : ил.

1.1. Стрептококки классификация, особенности строения клеточной стенки и жизнедеятельности.

1.2. Особенности строения клеточной стенки, вызываемые инфекции и факторы

патогенности

Глава II. Пеитидоглнкаилизнрующне ферменты ПЛФ бактериофагов.

2.1. Роль литичсских ферментов в жизненном цикле бактериофагов

2.2. Классификация пситидогликангидролаз, особенности строения и катализа.

2.3. Структурнофункциональные особенности бактериофагов С1 и К, продуцирующих в процессе жизненного цикла ферменты Р1уС и .

2.4. Перспективы применения ПЛФ бактериофагов в медицине

Глава III. Стабилизация ферментов

3.1. Общие принципы стабилизации

3.2. Стабилизация ферментов путем изменения свойств среды

3.3. Стабилизация ферментов методом иммобилизации
3.4 Стабилизация ферментов путем химической модификации
3.5. Стабилизация фермеров методами генной инженерии.
Глава IV. I остановка задачи.
ЭКСГШРИМЕНТАЛЫ1АЯ ЧАСТЬ
Глава V. Объекты и методы исследования
5.1. Характеристика ферментов, субстратов, использованных химических реактивов и оборудования.
5.1.1. Ферменты и субстраты
5.1.2. Химические реактивы.
5.1.3. Оборудование.
5.2. Измерение активности ферментов.
5.3. Изучение термоннакшвацин ферментов.
5.3.1. Исследование влияния на активность и стабильность ферментов.
5.3.2. Изучение температурной зависимости инактивации ферментов.
5.4. Стабилизация ЬуэК
5.4.1. Изучение влияния низкомолекулярных добавок на активность и стабильность .
5.4.2. Исследование влияния полиэлектроли тов на активность и стабильность
5.4.3. Модификация поверхностных аминогрупп ЬуК
5.4.4. Химическая иммобилизация ЬуК
5.5. Стабилизация Р1уС
5.5.1. Включение Р1уС в мицеллярнополюлскгролитныс композиции
5.5.2. Наложение внутримолекулярных сшивок
5.6. Изоэлсктричсское фокусирование, нативный и ДДС форезы
5.7. Титрование сульфгидрильных и аминогрупп, остатков триптофана, гистидина.
5.8. Спектроскопия круговою дихроизма. .
5.9. Флуоресцентная спектроскопия.
5 Ссдиментационный анализ.
5 Оценка пшрешностей в определении экспериментальных величин
РЕЗУЛЬ ТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Глава VI. Выявление закономерностей функционирования и инактивации бактериологических ферментов ЬуК и Р1уС
6.1. Компьютерное моделирование структур ферментов
6.1.1. Компьютерное моделирование структу ры ЬувК.
6.1.2. Компьютерное моделирование структуры Р1уС
6.2. Влияние , температуры и состава среды на ферменты ЬуэК и Р1уС
6.2.1. Влияние на активность и стабильность ЬуК.
6.2.2. Кинетические закономерности термоинактивации ЬувК
6.2.3. Влияние солевого состава среды на активность и стабильность ЬувК
6.2.4. Влияние . температуры и состава среды на активность и стабильность
Глава VII. Стабилизация фермента ГуяК
7.1. Стабилизация ЬуяК путем нековалентных взаимодействий
7.1.1. Стабилизация ГуяК при помощи органических низкомолекулярных добавок и поли меров.
7.1.2. Влияние реагентов тиолдисульфидного обмена на стабильность ЬузК
7.1.3. Влияние катионов металлов на стабильность ЬузК
7.1.4. Влияние полиэлсктролиюв на активность и стабильность ЬузК.
7.1.4.1. Стабилизация фермента Г.уК поликатнонами.
7.1.4.2. Особенности взаимодействия ЬуяК с полиаиионами
7.2. Стабилизация фермента ЬузК. путем образования ковалентных связей
7.2.1. Стабилизация ЬузК методом иммобилизации.
ГЛАВА VIII. Стабилизация фермента Р1уС.
8.1. Стабилизация Р1уС путем нековалентных взаимодействий включение фермента в состав мицеллярнополиэлектролитных композиций
8.2. Стабилизация Р1уС наложением химических сшивок
8.3. Испытание стабильных препаратов фермента Р1уС на живых клетках
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Стрептококки, вызывающие наибольшее число болезней человека, принадлежат к группе А пиогенным гноеродным стрептококкам. Большинство известных изолятов принадлежит к виду лгссос руоцепск. Стрептококк группы А вызывает около клинических форм инфекции 2. Таблица 1. Г руппы стрептококков и вызываемые ими инфекции 2 , . С iii. В патогенезе инфекций, вызываемых . Капсула поверхностная структура микроорганизма, состоящая из шилуроновон кислоты. О важности роли капсулы свидетельствует гот факт, что штаммы . Стреттолмэикы. КАОазы. М бе. Липотеихоеяая кислота
Рнс. Л. Схематичное изображение строения клетки 1гер1ососси руоепея, поверхностных и секрсчируеммх факIорок вирулентное п . Электронная микрофотография цепи стрептококка труппы А. Клеточная стенка стрептококка представляет собой сложную структуру, играющую важную роль и ей жизнедеяте. Клеточная стенка стрептококка СОСТОЙ из пспгылогликапа И ВСфОСННЫ. Ч я него молекул дипотейхосвой кислоты, участвующей в процессе адгезии. Пентндоглнкаи специфический пл ерошим мер. ИЗ остатков ацетп. К Мацетил му рамовон кислоте присоединен короткий нолипеигидный ХВОСГ. У рампо. Большинство различий относится к пептидной части молекулы . Две особенности пептидного хвоста заслуживают внимания наличие аминокислог и 1формс этим обусловлено главное отличие от белков, в молекулах которых аминокислоты находятся в I. Это имеет большое значение для пространственной организации пептпдоглнкана. Обе аминогруппы этих кислот могут принимать участие в образовании пептидных святей, причем вторые аминогруппы в формировании пептидных связей между гетерополимерными цепочками. Так можно сшить множество гстсрополимсркых пеней. Частота сшивок различна, так как не все пептидные хвосты участвуют в формировании межаепочечлых связей. Некоторые образуют ковалентные связи с другими молекулами, входящими в состав клеточной стенки, и, наконец, часть теграпептидов находится в свободном состоянии. Таким образом, пептцдогликаи одна гигантская молекула, сшитая при помощи гликозидных и пептидных связей. Наиболее распространенными аминокислотами псптидогдгоапа 5. ЯВ. ШЮТСЯ . Ргд гамииогт кислота. I.лизин. Оалашш 1. Рис. Структура повторяющейся единицы пешпдог. Саланин может быть заменен на серия или глицин, Оглутаминовая кислота на Оглутамин или 3окси1глугамин . Структура повторяющейся единицы пептнлогликана руорепе показана на рис. Липотсйхосвая кислота состоит из палигспперофосфвтюго скелета, связанного эфирными связями с аланином. Тейхоевые кислоты могут ковалентно соединяться с ацетилмурамовой кислотой. Поскольку это длинные линейные молекулы, они могут пронизывать весь псптндогликановыЯ слой, достигая внешней поверхности клеточной сгснки или же располааться параллельно ему. Остающиеся свободные гидроксилы придают сейхосной кислого свойства полиагиона. Как полианионы, тейхоевые кислоты определяют иоверчпоепшй заряд клетки . Полисахарид составляет сухой массы клеточной стенки и является ее грунлоспенифичсекнм компонентом, которому отводится важная рать в индукции аутоиммунных поражений гри стрептококковой инфекции. По структуре груипоснсиифичсских полисахаридных антигенов клеточной сгенкн стрептококки разделяют на серологических групп, обозначаемых латинскими буквами см. Например, полисахаридный компонент клеточной сгснки стрептококков группы Л содержит ,рамнозу и ацетнлглюкозоамин. С . Одной из отличительных черт структуры клеточной станки стрептококков является наличие в ос составе большою количества белковых компонентов до мол. С. рассматривается как один из главных фактором патогенности этих бактерий 1 Молекула Мбелка состоит из двух асииральных шхшиенгидных цепей, образующих суперспираль . Этот белок тормозит фагошггоз. Мбелку обусловлены прежде всего резким усилением фагоцитоза 2. Антитела к нем обеспечивают длительную невосприимчивость к повторному заражению. Существует множество вариантов строения Мбелка. Гшшрование стрептококков группы А на основании антигенных свойств Мбелка было предложено Р. Лансфилд. Существует более серотипоз но антигенным свойствам Мбелка. При инфицировании определенным Мсеротипом .