Характеристика новых мутантных форм пенициллинацилазы из Escherichia coli

• Автор: Шаповалова, Ирина Владимировна
• Шифр специальности: 02.00.15, 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 117 с. : ил.

Введение

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Антибиотики, как эффективные антиинфекционные препараты

1.1.1.0 механизме действия лактамных антибиотиков

1.1.2 Полусинтетические антибиотики

1.2 Пенициллинацилаза из .i

1.2.1 Структура пенициллинацилаз из . i

1.2.2 Каталитический механизм

1.2.3 Субстратная специфичность пенициллинацилаз

1.2.4 Строение участка связывания ацильной части субстрата

1.2.4.1 Ингибирование пенициллинацилаз производными

фенилуксусной кислоты
1.2.5 Участок связывания нуклеофила
1.2.5.1 Изучение участка связывания боковой группы субстрата р2
1.2.5.2 Изучение участка связывания карбоксильной группы субстрата рЗ
1.2.6 О зависимости каталитической активности
1.2.7 Кинетическая схема реакций ацильного переноса, катализируемых пенициллинацилазой из . i ,
1.3 Изучение структурнофункциональных взаимосвязей в пенициллинацилазе
1.3.1 Об опыте использования сайтнаправлснного мутагенеза с целью
улучшения пенициллинацилазы для синтеза лактамных антибиотиков
1.3.2Использование новейших технологий для изучения ПА из .i
1.4 Исследование субстратной специфичности и изучение кинетики
мутантных ферментов
1.4.1 Мутагенез, основанный на анализе аминокислотной последовательности
1.4.2 Случайный мутагенез
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1 Материалы
2.2 Методы
2.2.1 Сайтнаправленный мутагенез пенициллинацилазы из .i
2.2.2 Экспрессия и очистка мутантных ферментов
2.2.3 Определение концентрации активных центров нативной пенициллинацилазы
2.2.4 Определение концентрации активных центров мутантных пенициллинацилаз
2.2.5 Определение кинетических параметров ферментативного гидролиза
цветных субстратов
2.2.6 Синтез 4фенилацетилН.фенилглицил8цистеина
2.2.7 Предколоночная модификация аминогрупп офталевым альдегидом
2.2.8 ВЭЖХанализ 2.2.пределение константы Км в реакции гидролиза
Ыфепилацетилыгых производных аминокислот
2.2. Определение кК2т гидролиза Ифенил ацетильных производных аминокислот под действием пенициллинацилаз
2.2. Определение концентрации свободных аминогрупп
2.2. Изучение стабильности пенициллинацилазы
2.2. Хроматографический анализ реакционной смеси при синтезе антибиотиков
2.2. Ферментативный синтез ампициллина, катализируемый нативной
и мутантными пенициллинацилазами в гомогенной водной системе
2.2. Ферментативный синтез цефалексина, катализируемый мутантной пенициллинацилазой аА5Ьеи
2.2. Определение кинетических параметров реакции ферментативного синтеза ампициллина и цефалексина
2.2. Определение реакционной способности 6АРА как нуклеофила
в реакции синтеза ампициллина
2.2. Определение реакционной способности 7АБСА как нуклеофила
в реакции синтеза цефалексина
3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Введение
3.1Изучение пенициллинацилаз с точечной мутацией по остатку рРйе
3.1.1 Профиль субстратной специфичности и каталитической эффективности действия мутантных ферментов
3.1.2 Изучение способности мутантных ферментов катализировать ацильный перенос на ядра рлактамных антибиотиков в водной среде
3.1.3 Изучение стабильности мутантных ферментов в щелочной и кислой среде
3.1.4 Стереоселективность действия мутантных ферментов при гидролизе Ыфенилацетильных производных аминокислот
3.1.4.1 Новый реагент ЫфеиилацетилКфенилглицил8цистеин для предколоночиой модификации с офталевым альдег идом при определении отдельных энантиомеров
3.1.4.2 Стереоселективность действия фермента
3.2 Изучение пенициллинацилаз с точечной мутацией по остатку рРИе
3.3 Синтез Рлактамных антибиотиков методом ацильного переноса
в водной среде, катализируемого пенициллинацилазами
3.4 Исследование каталитических свойств ферментов с точечной мутацией по остаткам аРйеНб и аАг 5
3.4.1 Изучение стабильности мутантных ферментов
3.4.2 Способность мутантных ферментов катализировать ацильный перенос
3.4.3 Характеристика мутантного фермента слАгцМЗЬеи как катализатора
синтеза антибиотиков в водной среде
3.4.4 Изучение субстратной специфичности и каталитической активности мутантных ферментов
3.4.5 Изучение стереоселективности мутантного фермента аАгд5Ьеи
3.5 ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Оно представляло собой соединение мышьяка и получило название сальварсан от латинского v спасать и i мышьяк. В году, после открытия бледной спирохеты, сальварсан стал использоваться как лекарство против сифилиса. Так еще до открытия природных антибиотиков были получены вещества, позволяющие бороться с инфекциями. В году русский микробиолог П. Н. Лащенков получил из куриного яйца вещество, которое задерживало развитие некоторых микробов. Позже Александр Флеминг обнаружил это вещество в тканях сердца, печени, легких, а также в слюне и слезах человека. Он назвал его лизоцимом, но практического значения ему не придал. Этот фермент, как мы понимаем сегодня, способен разрушать клеточную стенку бактерий и может быть использован как лекарственное средство, например, при лечении инфекций горла, а также в стоматологии, однако не является столь специфичным и эффективным лекарством как современные низкомолекулярные антибиотики. В году немецкий бактериолог Герхард Домагк обнаружил, что красный азокраситсль, синтезированный под названием пронтозил как краситель для быстрого окрашивания кожаных изделий, в комбинации с сульфонамидным радикалом оказывается эффективным против стрептококковых инфекций. Лечебный эффект был настолько существенным, что Г. Домагку за открытие антибактериального эффекта пронтозила была присуждена Нобелевская премия по физиологии и медицине в году. Как выяснилось позже, пронтозил, или красный стрептоцид, сам по себе не обладает антибактериальной активностью. В результате преобразований в организме он превращается в сульфаниламид белый стрептоцид, который и воздействует на микробные клетки. Собственно сульфаниламид был синтезирован еще в году австрийским студентомхимиком П. Гельмо как основа для устойчивых красителей, однако в течение лет никто не догадывался о его антимикробном действии. Начиная с х годов были синтезированы тысячи различных сульфаниламидов, но медицинское применение нашли лишь из них наиболее известны сульфаниламид стрептоцид и полученные на его основе сульфатиазол, сульфапиридазии, сульфадиазин, этазол, сульфадоксин, сульфацетамид сульфацил. С течением времени и благодаря новым открытиям сульфаниламиды потеряли свое исключительное значение изза токсичности и устойчивости микроорганизмов. Первым из обнаруженных природных антибиотиков является пенициллин . В году Л. Флеминг обнаружил, что гриб iii выделяет соединение, прекращающее рост граммположитсльных бактерий . В году Г. Флори и Э. Чейн провели более подробное исследование соединений с противомикробной активностью, в рамках которого был получен очищенный пенициллин и изучен его терапевтический эффект. Пенициллин оказался чрезвычайно эффективным средством для лечения гноеродных инфекций, ран, газовой гангрены, сепсиса, пневмонии, осложнений при дифтерии, скарлатине и т. Первые клинические испытания пенициллина завершились в году, и уже через несколько лет он широко применялся, позволив спасти миллионы жизней. Важную роль в создании промышленности пенициллина в США и Великобритании сыграл секретный англоамериканский проект, благодаря которому очень быстро для того времени был создан новый биотехнологический процесс и налажено масштабное производство пенициллина. Благодаря усилиям З. В.Ермольевой и руководимой ей лаборатории во время Великой Отечественной войны в Советском Союзе было независимо создано производство пенициллинакрустозииа, продуцируемого iii 1. Отечественный пенициллин, производство которого было быстро налажено, нашел широкое применение на фронтах и стал основой промышленности антибиотиков в СССР 2. В г. Совета Министров СССР был основан ВНИИ по пенициллину и другим антибиотикам сегодня Государственный научный центр но антибиотикам, ГНЦА, который стал ведущим научным центром по разработке новых технологий и обеспечил создание промышленности антибиотиков в Советском Союзе, ставшей одной из крупнейших в мире. Как было установлено значительно позже, пенициллин, как и другие рлактамные антибиотики, обладает уникальной, ранее неизвестной, структурой, на установление которой потребовалось более лет. Химическую структуру пенициллина рис.