Синтез и изучение свойств поликатионных липофильных агентов трансфекции

• Автор: Петухов, Иван Алексеевич
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 107 с.

Содержание

Список сокращений.

1. Введение.

2. Литературный обзор.

2.1 Введение и основные положения генной терапии.

2.2. Невирусные векторы на основе поликатионных амфифилов.

2.3. Свойства и эффективность геминисурфактантов

2.4. чувствительные конъюгаты для биомедицинского применения

2.5. Полимеры, липиды и биоконъюгаты, чувствительные к восстановлению

2.5.1. Катионные полимеры, чувствительные к действию восстанавливающих агентов для внутриклеточной доставки НК

2.5.2. Полипептиды и белки, чувствительные к восстановлению

2.5.3. Липосомы, чувствительные к действию восстановливающих агентов.
3. Обсуждение результатов
3.1. Получение избирательно защищенных производных спермина
3.2. Получение производных холестерина с различными линкерными группами
3.2.1. Синтез бромпроизоодных холестерина со сложноэфирным и уретановым линкером.
3.2.2. Синтез галогенпроизводных холестерина с кислотолабильным 0,0ацетальным линкером.
3.2.3. Синтез амино и карбоксипроизводных холестерина с дисульфидной группой в составе спейсера.
3.3. Конденсация холестериновой и сперминовой компонент. Получение целевых поликатионых
амфифилов
3.3.1. Синтез амфифилов типа головахвост и геминиамфифилов со сложноэфирным и уретановым линкером
3.3.2. Синтез поликатионных амфифилов с ацетальным линкером
3.3.3. Получение поликатионных амфифилов с дисульфидной связью.
3.4. Биологические исследования поликатионных амфифилов
3.4.1. Изучение токсичности синтезированных амфифилов
3.4.2. Доставка Б1ТСмеченного дезоксирибонуклеотида Р1ТССЮМ комплексами на основе амфифилООРЕ.
3.4.2. Доставка плазмидной ДНК комплексами на основе амфифилЮОРЕ.
4. Выводы.
5. Экспериментальная часть.
Список использованной литературы


Она направлена на устранение наследственных и приобретенных заболеваний и использует экзогенные нуклеиновые кислоты НК как самостоятельные терапевтические субстанции. Генная терапия используется, прежде всего, для лечения классических наследственных заболеваний с изолированным одиночным дефектом гена, а так же при лечении приобретенных ВИЧ, хронические инфекционные заболевания и мультифакторных генетических заболеваний рак, сердечнососудистые заболевания рис. Моногенные заболевания 9. Заболевания кровеносных сосудов 8. Инфекционные заболевания 6. Другие заболевания 2. Геннозависимые 8. Здоровые люди, находящиеся под медицинским наблюдением 0. Рис. Основная идея соматической генной терапии очень проста терапевтический ген вводят в клетку организма, чтобы остановить течение заболевания или, по крайней мере, замедлить его. Решающими условиями успешного осуществления генотерапевтического подхода является обеспечение эффективной доставки лечебной НК. Современные методы генетической трансформации клеток лишь частично отвечают указанным выше требованиям 1,2. Физические методы электропорация, микроинъекция. В настоящее время наиболее эффективными системами доставки являются вирусные векторы. Благодаря полусинтетической природе существует возможность варьирования размеров и физикохимических характеристик липосом. Важнейшей предпосылкой для успешного применения генной терапии является эффективная доставка и последующая экспрессия желаемого гена в клеткахмишенях. Рис. При проведении трансфекции i viv транспортное средство, содержащее терапевтическую НК, должно попасть от места его введения к месту терапевтического действия. После внутривенного введения комплекс ДНКпереносчик липоплекс в случае катионных амфифилов, полиплекс катионных полимеров попадает в кровяное русло, которое представляет собой серьезное препятствие для достижения эффективной трансфекции, поскольку комплекс взаимодействует с компонентами крови, инактивируется и выводится из организма 3. Если комплекс преодолевает этот этап, то следующим барьером для него является клеточная мембрана. Для преодоления этого препятствия комплексу необходимо иметь небольшой избыточный положительный заряд, для взаимодействия с отрицательно заряженной клеточной мембраной рис. ОТАР 1ДНК внутрь клетки может происходить посредством клатринопосредованного эндоцитоза, в то время как полиплекс полиэтиленимин РЕДНК может проникать внутрь клетки двумя способами через кавеолин или клатринокаймленные ямки 4. Однако, пути интернализации, повидимому, зависят от используемой системы доставки и от типа трансфицируемых клеток. Системы доставки, содержащие нацеливающий лиганд, распознаваемый специфическими рецепторами на поверхности клеткимишени, могут проникать внутрь клетки посредством адсорбционного и рецепторопосредованного эндоцитоза 5. Макропиноцитоз также может опосредовать проникновение катионных носителей, так как этот механизм помогает проникать в клетку таким большим структурам, как бактерии 6. Иногда липоплексы и полиплексы проникают в клетку посредством фагоцитоза 7. Кроме того, на способ проникновения в клетку могут влиять такие, факторы, как состав клеточной мембраны и размер комплексов. После проникновения в клетку комплексам необходимо высвободиться из эндосомы, однако, механизм, позволяющий это сделать, до сих пор еще не определили, но он, повидимому, зависит от состава мембраны клетокмишеней. Одна из гипотез базируется на физическом разрушении отрицательно заряженной мембраны эндосомы, благодаря взаимодействию липидов мембраны эндосомы с катионным амфифилом или полимером 8. Другое предположение основано на способности аминогрупп, полимера или поликатионного амфифила к ионизации иполучило название гипотеза протонной,губки 9. Эндосомальная мембрана имеет в своем составе АТФазу, которая ответственна за накачку в эндосому протонов. Аккумуляция протонов в везикуле приводит к притоку противоионов, которые вызывают осмотическое разбухание и разрыв эндосомальной мембраны, что, в свою очередь, приводит к высвобождению комплекса в цитоплазму рис.