Модифицированные олигонуклеотиды - ингибиторы интеграции ДНК вируса иммунодефицита человека

• Автор: Пинская, Марина Давидовна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 133 с. : ил

Введение.

I. Интеграция ДИК вируса иммунодефицита человека в ДНК клетки

и ее ингибирование соединениями нуклеотидной природы обзор литературы.

1.1. Репликативный цикл ВИЧ.

1.2. Интеграция ДНК ВИЧ1 в геном клетки.

1.3. Строение интегразы ВИЧ

1.4. Ингибиторы интеграции ДНК ВИЧ1.

1.4.1. Ингибирование интегразы ВИЧ1 нуклеотидами и

их аналогами.

1.4.2. Ингибирование интеграции ДНК ВИЧ1 олигонуклеотидами.

1.4.2.1. Ингибирование интеграции ДНК ВИЧ1 триплексобразующими олигонуклеотидами.

1.4.2.2. Ингибирование интегразы ВИЧ1 олигонуклеотидами
1.5. Использование олигонуклеотидов в качестве противовирусных
препаратов.
П. Модифицированные олигонуклеотиды ингибиторы интеграции
ДНК вируса иммунодефицита человека
обсуждение результатов
II. 1. Конъюгаты о л игонуклеотидов с ароматическим
заместителем.
П.1.1. Конъюгаты разветвленных олигонуклеотидов
с оксазолопиридокарбазолом.
И. 1.1.1. Изучение формирования ЗЗразветвленными
олигонуклеотидами триплекса с И5 фрагментом ДНК ВИЧ
и самокомплементарных структур
.1.1.2. Подбор оптимальных условий для изучения ингибирования ферментативной активности интегразы ВИЧ1 в реакциях Зконцевого процессинга и переноса цепи с помощью
модифицированных олигонуклеотидов.
II. 1.1.3. Ингибирование интеграции ДНК ВИЧ
ЗЗразветвленными олигонуклеотидами и их
конъюгатами с оксазолопиридокарбазолом
II. 1.2. Конъюгаты природных олигонуклеотидов с ароматическим
заместителем.
.1.2.1. Ингибирование интеграции ДНК ВИЧ
конъюгатами природных олигонуклеотидов с ароматическим
заместителем
II. 1.2.2. Выявление структурных детерминант ингибирующей активности конъюгатов
олигонуклеотидов с ароматическими заместителями.
.2. Олигонуклеотиды, содержащие модифицированные гетероциклические основания
.2.1. Ингибирование интеграции ДНК ВИЧ1 олигонуклеотидами, содержащими 6оксоцитозин.
.3. Механизм ингибирования интегразы ВИЧ
модифицированными олигонуклеотидами
.3.1. Влияние модифицированных олигонуклеотидов на формирование комплекса интегразы с 5 фрагментом ДНК ВИЧ1.
.3.2. Взаимодействие модифицированных олигонуклеотидов с
интегразой ВИЧ1.
.3.3. Действие модифицированных олигонуклеотидов на каталитическую активность интегразы ВИЧ1 в составе ее комплекса с субстратом
И.3.4. Влияние модифицированных олигонуклеотидов на устойчивость
комплекса интегразы с фрагментом ДНК ВИЧ
II.4. Ингибирование активности прединтеграционного комплекса, выделенного из ВИЧинфицированных клеток,
модифицированными олигонуклеотидами
III. Экспериментальная часть.
III.1. Реактивы и материалы.
III.2. Методы.
Ш.2.1. Синтез конъюгатов олигонуклеотидов с ароматическими
заместителями
Ш.2.2. Физикохимические методы изучения формирования
олигонуклеотидами вторичных структур и их комплексов с ДНК ВИЧ
1.2.3. Изучение действия олигонуклеотидов на каталитическую
активность интегразы ВИЧ1.
Ш.2.4. Изучение взаимодействия олигонуклеотидов с интегразой ВИЧ
и ее комплексом с и5 субстратом
Литература
СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ В работе использованы символы и сокращения структурных компонентов нуклеиновых кислот в соответствии с рекомендациями Комиссии по номенклатуре Международного союза чистой и прикладной химии I и международного Союза биохимиков I, а также следующие обозначения
Адам адамантан
Акр акридин
Антр антрахиноы
АТФ аденозин5трифосфат
ВИЧ1 вирус иммунодефицита человека типа
ДКП длинный концевой повтор
ДМС диметилсульфат
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
ДТТ дитиотреитол
ИН интеграза
КД круговой дихроизм
НК нуклеиновая кислота
Он к оксазолопиридокарбазол
ПААГ полиакриламидный гель
ПИК прединтеграционный комплекс
РНК рибонуклеиновая кислота
СПИД синдром приобретенного иммунодефицита человека ТОО триплексобразующий олигонуклеотид Фл флуоресцеин
ЭДК 1этилдиметиламинопропилкарбодиимид
ЭДТА этилендиаминтетраацетат натрия
ВРВ бромфеноловый синий
I флуоресцеинизотиоционат, изомер I
II i iv ivi
гексафлуорофосфат 0бензотриазол1илМ,М,М,Мтетраметилуроний
II гидрокснэтил1пиперазин этан сульфоновая кислота
оксибензотриазол
i i i
i трисгидроксиметнламинометан
ХС ксиленцианол
ВВЕДЕНИЕ


Для понимания и оценки различных подходов к ингибированию вируса рассмотрим основные этапы репликативного цикла ВИЧ. Вирус иммунодефицита человека принадлежит к классу ретровирусов. Следует отметить, что существует два типа вируса ВИЧ1 и ВИЧ2, которые незначительно отличаются друг от друга строением генома 7 8. В частности, РНКгеном ВИЧ2, кодирует белок Vx, ответственный за инфицирование макрофагов и распространение вируса, однако, в его геноме отсутствует ген белка V, который отвечает за регуляцию клеточного рецептора 4 и белков МНС1, участвующих в иммунном узнавании Тлимфоцитов, а также стимулирует отпочковывание вируса. Настоящая работа была посвящена ингибированию интеграции ДНК ВИЧ типа 1, как более патогенному и более широко распространенному типу вируса. Поэтому далее в обзоре литературы будут рассмотрены вопросы, связанные с репликацией и ингибированием интеграции ДНК именно ВИЧ1. Рассмотрим основные этапы развития ВИЧ1. Его репликативный цикл условно можно разделить на две фазы 1 раннюю, которая начинается с узнавания клеткимишени зрелым вирионом и включает все процессы, ведущие к интеграции вирусной ДНК в хромосому зараженной клетки и 2 поздшою фазу, начинающуюся с регулируемой экспрессии интегрированного провирусного генома и заканчивающуюся отпочковыванием и созреванием вируса рис. Частицы ВИЧ1 связываются специфично только с клетками, несущими на поверхности белок 4. Связывание вируса с 4 осуществляется через специфическое взаимодействие гликопротеина оболочки вируса и концевого домена иммуноглобулина белка 4. Для проникновения вируса в клеткумишень необходимы также дополнительные белки, в частности, хемокиновые рецепторы X4, 5. Вслед за проникновением следуют процессы раздевания и высвобождения внутриклеточного предтранскрипционного комплекса. Обратная транскрипция геномной РНК осуществляется вирусным ферментом обратной транскриптазой в цитоплазме. Возможно, на этом этапе важную роль играют вспомогательный вирусный белок Vi. РНК ВИЧ
Рис. Строение зрелого вириона и репликативный цикл ВИЧ1. Праймером для синтеза цепи кДНК служит клеточная часть которой образует комплементарный комплекс с праймер связывающим участком вирусного генома. Далее эта ДНК используется в качестве матрицы для синтеза двуцепочечной кДНК. Двуцепочечная кДНК транспортируется в ядро в составе прединтеграциониого комплекса, включающего ряд вирусных белков интегразу, матриксный белок р. V, а также клеточные белки. Локализация прединтеграциониого комплекса в ядре определяется белком р и V. После транспорта в ядро кДНК ковалентно интегрируется в геном клетки хозяина благодаря каталитической активности вирусного фермента интегразы с образованием провирусной ДНК. Детальный механизм процесса интеграции будет рассмотрен ниже в разделе 1. Поздняя фаза репликативного цикла вируса начинается с транскрипции вирусных генов. Контроль за экспрессией вирусного генома осуществляют как клеточные, так и вирусные факторы. ДНК содержт ряд последовательностей для посадки полимеразы и факторов транскрипции, в частности, последовательность ТАТА А сайг посадки клеточной РНКиолимеразы типа II, энхансерные последовательности, с которыми связываются клеточные факторы и , а также модуляторы для связывания целого ряда других клеточных факторов. Сначала транскрибируются те части провирусной ДНК, которые кодируют регуляторные белки , v и . Ранние РНКтранскрипты экспортируются из ядра в цитоплазму и подвергаются сплайсингу и трансляции. Белок образуется в результате трансляции дважды сплайсированной мРНК. Поздние РНКтранскрипты остаются на этом этапе в ядре и деградируют. Белки и v направляются в ядро. В ядре кооперативно связывается с последовательностью вирусной РИК и циклимом Т1. В результате такого взаимодействия киназа 9. Скоццевой домен клеточной РНКполимеразы II, повышая процессивность фермента. Это позволяет полимеразе осуществлять транскрипцию поздних мРНК . Белок v участвует в процессе транспорта поздних мРНК вместе с клеточным ядерным белком экспортином1 и ядерным фактором экспорта, гуанозинтрифосфатазой .