Идентификация и картирование участков ДНК, специфически связывающихся с ядерным матриксом, на хромосоме 19 человека

• Автор: Чернов, Игорь Павлович
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 114 с. : ил

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Доменная организация генетического материала в клеточном ядре.

I. Упаковка генетического материала в клеточном ядре

И. Остаточные структуры интерфазног о ядра и их биохимический состав

.1. Белки остаточной ядерной оболочки

.2. Белки остаточного ядрышка

.3. Белки внутреннего ядерного .матрикса

.4. Минорные белки

.5. Другие компоненты ядерного матрикса

III. ДНК в составе ядерного матрикса, ее свойства и функции

III. 1. Определение и способы получения Д1К ядерного матрикса

1.2. Структурные особенности ДНК ядерного матрикса
II 1.3. Функции ДНК ядерного матрикса
1.3.1. Петельные домены
1.3.2. Тканеспецифичность доменов
1.3.3. Нейтрализация эффекта положения
1.3.4. как участки интеграции ретровирусных векторов
И 1.3.5. в составе ретроэлементов
IV. Белки специфически связывающиеся с элемента ми
V. Доменная структура хроматина в геномном контексте
V и петлевые домены
V.2. и геномные последовательности
V.3. Интронные
V.4. и другие регуляторные элементы генома
VI. Заключение и постановка задачи
ЭКСПЕРИМЕНТ АЛЫ Я ЧАСТЬ
1. Оборудование и материалы
1.1. Оборудование
1.2. Реактивы
1.3. Штаммы бактерий и бактериофаги
1.4. Плазмиды и космиды
1.5. итательные среды
2. Методы
2.1. Выделение препаратов ядерного матрикса из культур клеток высокосолевым методом
2.2. Получение ядерного матрикса методом I экстракции
2.3. Получение библиотеки фрагментов ДПК локуса IX7 хромосомы человека
2.4. Селекция фрагментов ДНК. связывающихся i vi с ядерным матриксом полученным методом эксгакции i
2.5. Клонирование библиотеки и трансформация клеток . i.
2.6. Приготовление компетентных клеток .i и их трансформация
2.7. Ранжирование и анализ библиотеки
2.8. Перенос ДНК на нейлоновый фильтр блоттинг и гибридизация с радиоактивно меченым зондом
2.9. Радиоактивное мечение фрагментов ДПК при помощи ПЦР
2 Секвенирование
2 Очистка праймеров
2 Связывание меченых фрагментов Д1I с ядерным матриксом i vi
2 Гибридизация с космиднымн библиотеками хромосомы с использованием фильтров высокой плотности
2 Проверка результатов гибридизации с помощью ПЦР и определение точного расположения 5 I
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Картирование на хромосоме человека
1.1 Генное окружение элементов
1.2 Связывание с ядерным матриксом повторяющихся элементов генома.
2. повторяющийся элемент на хромосоме человека.
2.1 Характеристика повторяющегося элемспта.
2.2 Расположение элемента на хромосоме человека.
2.3 Первичные структуры элементов.
3. Идентификация и картирование в локусе 8X
3.1 Конструирование библиотеки фрагментов ДНК. предпочтительно связывающихся с ядерным матриксом
3.2 Анализ библиотеки при помощи IГЦР
3.3 Определение коэффициента связывания клонов библиотеки с
ядерным матриксом i vi
3.4 Анализ первичной структуры клонов
3.5 Компьютерный анализ секвенированных клонов и их картирование
3.6 Общая организация локуса 8X
3.7 элементы внутри генов
ОСНОВ 1ЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


В то же время геном содержит множество нетранскрибируемых функционально активных элементов, обладающих важнейшими регуляторными свойствами и имеющими критическое значение для его нормальной работы. Примерами таких структур могут служить энхансеры, терминаторы транскрипции, участки связывания ДНК с регуляторными белками, участки начала репликации, места интеграции ретроэлементов и т. В большинстве случаев подобные структуры невозможно идентифицировать, имея данные только о нуклеотидной последовательности участков ДНК, которые их содержат. Единственным способом их корректной идентификации является соответствующий каждому конкретному слушаю экспериментальный функциональный подход. Картирование последовательностей с известной функциональной ролыо значительно облегчает понимание общей организации и основных принципов регуляции работы генома как целого. Решение задачи картирования функциональных элементов генома сопряжено со значительными трудностями. Они обусловлены, в первую очередь, чрезвычайным многообразием самих функционально значимых последовательностей, обнаруживаемых в геноме человека, а потому необходимостью применения большого арсенала разнообразных методических приемов, с помощью которых они могут быть выявлены среди множества других последовательностей тотальной геномной ДНК. Одним из важных структурнофункциональных элементов клеточного ядра, ответственным за образование и регуляцию активности хроматина, являются участки прикрепления ДНК к ядерному матриксу. Скелетная структура интерфазного ядра ядерный матрикс имеет повышенное сродство к последовательностям определенного типа ix i, , что делает ядерный матрикс уникальным инструментом, позволяющим отобрать те фрагменты ДНК, которые осуществляют прикрепление интерфазного хроматина к ядерному матриксу и образуют его петельнодоменную структуру. Гены, расположенные в различных доменах, физически изолированы друг от друга связанными с ядерным матриксом элементами, и способны регулироваться независимо. В настоящей работе указанное свойство ядерного матрикса было использовано для отбора и идентификации фрагментов ДНК, предпочтительно связывающихся с ядерным матриксом, в локусс длиной около 1 млн. X7I хромосомы человека. Этот локус содержит значительное число известных генов и его нуклеотидная последовательность полностью установлена, что позволило, как картировать все отобранные элементы с большой точностью, так и сделать выводы о взаимном расположении матрикссвязанных элементов и генов и их возможной функциональной взаимосвязи. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Доменная организация генетического материала в клеточном ядре. I. Упаковка генетического материала в клеточном ядре. Идея упорядоченной организации хроматина в ядре возникла сразу же после наблюдения Флеммингом под микроскопом хромосомных ламповых щеток i, . Второе рождение идея обрела после получения электронных микрофотографий, где основания петель ДНК были прикреплены к белковой оболочке метафазных хромосом i, . К настоящему времени принципы организации ДНК в составе хроматина хорошо изучены. Модель такой организации была предложена еще в конце х годов на основании результатов биохимических и электронномикроскопических исследований, и с тех пор не претерпела существенных изменений, хотя проведенные в последующие годы исследования заметно расширили наши представления о высших уровнях организации хроматина, для которых была установлена их связь с функционированием генетического материала . Принято выделять три уровня компактизации ДНК в ядре рис. ДК находится в комплексе с белкамигистонами 1 А, Н2В, НЗ и 4, образующими сердцевину нуклеосомы имеющую в своем составе по две молекулы каждого белка и гистоном III, имеющим сродство к межнуклеосомным линкерным участкам. Такая сердцевина имеет вид диска диаметром нм и высотой 5,7 нм. ДНК располагается на поверхности нуклеосомы, образуя 1. ДНК длиной пар нуклеотидов. Индивидуальные нуклеосомы соединены линкерными участками, длина которых варьирует гораздо сильнее, чем длина ДНК, связанной с сердцевиной нуклеосомы, поэтому длина полного нуклеосомного повтора может изменяться от 5 п. I . Рис. Уровни компактизации хроматина в интерфазном ядре.