Функционально-важные остатки аминокислот неорганических пирофосфатаз S. Cereviciae и e. coli

• Автор: Разников, Андрей Валерьевич
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1992
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 129 с. : ил

1 . РАСТВОРИМЫЕ ПИР0ФФАТАЗЫ ИЗ РАЗЛИЧНЫХ ИСТОЧНИКОВ

. Пирофосфатаза .vii

1 .А. 1. Обще свойства фермента

1 .А.2. Функциональноважные аминокислотные остатки

1.А.2.1. Химическая модификация

1.А.2.2. Рентгеноструктурный анализ

Б. Пирофосфатаза .i

1.Б.1. Обще свойства фермента

1 .Б.2. Функциональноважные, аминокислотные остатки

. Пирофосфатаза термофильной бактерии 3

Г. Пирофосфатаза Т. i

Д. Пирофосфатаза .i
Е. Пирофосфатаза .ixi
Ж. Пирофосфатаза В. i
3. Пирофосфатаза .
И. Пирофосфатаза .ii
2. ПРЕДПОЛАГАЕМЫЙ ОБЩИИ МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ НЕОРГАНИЧЕСКИХ ПИ
РОФОСФАТАЗ. ОТЛИЧИЯ ФЕРМЕНТОВ ИЗ РАЗНЫХ ИСТОЧНИКОВ
ГЛАВА II. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
1. Функциональноважный остаток тирозина в пирофосфатазе
.vii
1.1. Химическая модификация и локализация в первичной структуре
1.1.1. Инактивация и модификация пирофосфатазы
1.1.2. Определение природы остатка, модификация которого приводит к инактивации фермента
1.1.3. Локализация в первичной структуре функциональноважного остатка тирозина
1,2. Возможная роль Туг в механизме действия фермента
1.2.1. Влияние лигандов активного центра на реакционное состояние Туг
1.2.2. Гипсохромный эффект в спектре поглощения пирофосфатазы, модифицированной
1.2.3. Аномальная реакционная способность остатка Туг
1.2.4. Функциональная роль остатка Тугв9
2. Функциональноважный остаток глутаминовой кислоты в лирофосфатазе .i
2.1. Химическая модификация и локализация в первичной структуре
2.1.1. Инактивация и модификация фермента
2.1.2. Локализация функциональноважного остатка дикарбоновой аминокислоты в первичной структуре пирофосфатазы
2.2. Возможная роль остатка глутаминовой аминокислоты в механизме действия фермента
2.2.1. Аффинная элюция
2.2.2. Активность модифицированного фермента
2.2.3. Возможная функциональная роль остатка Е
3. Селективная модификация пирофосфатазы .i реагентом Вудворда К вне активного центра
ГЛАВА III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
1. Методы исследования
1.1. Определение концентрации белка
1.2. Определение активности ферментов
1.3.Определение количества радиоактивных веществ
1.4. Протеолиз
1.4.1. Алкилирование групп
1.4.2. Гидролиз трипсином
1.4.3. Гидролиз протеазой i V8
1.4.4. Гидролиз химотрипсином
1.5. Ступенчатая деградация по методу Эдмана
1.6. Массспектрометрический анализ пептидов
2. Исследование реакции РРазы .vii с 4хлор7нитро
бензо2окса1,3диазолом
2.1. Инактивация фермента
2.2. Получение модифицированного фермента
2.3. Спектры поглощения модифицированного фермента
2.4. Определение природы модифицированной аминокислоты
2.4.1. Реактивация модифицированной РРазы
2.4.2. Инактивация РРазы с модифицированными груттами
2.4.3. Модификация грулп РРазы, модифицированной
2.5. Локализация в первичной структуре функциональноважного остатка тирозина
2.5.1. Разделение пептидов
2.5.2. Установление структуры пептидов
2.6. Выяснение возможной функциональной роли остатка тирозина
2.6.1. Влияние ионов металлов
2.6.2. Влияние фосфата
2.6.3. зависимость скорости инактивации
3. Исследование реакции РРазы .i с реагентом Вудворда К.
3.1. Изучение устойчивости реагента Вудворда К при различных
3.2. Инактивация фермента
3.3. Получение модифицированного фермента
3.4. Исследование устойчивости винилового эфира, образующегося при модификации РРазы реагентом Вудворда К
3.5. Локализация в первичной структуре функциональноважного остатка дикарбоновой аминокислоты
3.5.1. Разделение пептидов
3.5.2. Установление структуры пептидов
3.6. Выяснение возможной функциональной роли остатка дикарбоновой аминокислоты
3.6.1. Аффинная элюция
3.6.3. зависимость остаточной активности модифицированного фермента
4. Селективная модификация пирофосфатазы .i реагентом Вудворда К вне активного центра
4.1. Модификация РРазы
4.2. Выделение модифицированного пептида
4.3. Установление структуры пептида
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА


М.Хьюз подчеркивал, что первый шаг на пути к пониманию функционирования металлопротеинов должен включать описание взаимодействия металлбелок, а именно определение природы связываемых групп и силы их взаимодействия с металлом 5. В настоящее время известно, что в область активного центра РРазы обращены боковые группы более чем тридцати различных аминокислот, которые могут принимать участие в связывании ионов металлаактиватора, субстрата, стабилизировать переходное состояние, быть каталитическими группами. Для некоторых остатков показана их важность в ферментативном катализе с помощью химической модификации или сайтнаправленного мутагенеза. Несмотря на существенные достижения в этом направлении, лишь для ограниченного числа остатков аминокислот продемонстрирована функциональная значимость. РРазы являются либо гипотетичными, либо описывают только самые общие принципы. Целью настоящей работы являлось продолжение изучения механизма действия РРазы по пути выявления и определения рож функциональноважных остатков аминокислот. В первой главе представлены данные жтературы, касающиеся изучения функциональноважных остатков аминокислот растворимых РРаз, выделенных из различных источников. Обзор построен следующим образом первая часть содержит информацию о функциональноважных остатках, здесь же рассмотрены основные свойства наиболее изученных РРаз из . Во второй главе обсуждаются результаты экспериментов по изучению функциональной роли остатков тирозина в РРазе . РРазе . Третья глава посвящена описанию реагентов и экспериментальных методик, использованных в работе. А Пирофосфатаза . А.1 Общие свойства фермента. Фермент является димером, каждой субъединицы СЕ состав
ляет кДа 6, размер молекулы 0xx А 7. СЕ в молекуле РРазы симметричны относительно оси второго порядка и представляют собой две идентичные полипептидные цепи 8. РРаза диссоциирует на мономеры в результате обработки обычными денатурирующими агентами, а также при длительной инкубации в буферах с высоким или низким значением 7. С помощью обработки малешовым ангидридом при . СЕ через остатки или можно предотвратить процесс реконструкции димера. Отдельная СЕ РРазы обладает полной каталитической активностью в реакции гидролизасинтеза РР. Следовательно, вероятно, структура активного центра прямо не связана с олигомерной структурой фермента, в то же время показано, что последняя существенна для состояния центров, способных связывать анионные эффекторы и, повидимому, необходима для регуляции работы РРазы i viv. Офюсфоэтаноламином ,, 0фосфосерином и его метиловым эфиром , и метилфосфатом ,, а впоследствии подтвердилось данными рентгеноструктурного анализа. В качестве объяснения неодинакового поведения СЕ в составе димера предложена гипотеза индуцированного конформационного изменения, передающегося из одной СЕ на вторую 7. Следует заметить, что молекулярный механизм подобной передачи не установлен, это связано с отсутствием данных об остатках аминокислот, которые принимают участие в этом процессе. В качестве альтернативного объяснения можно предположить существование пострибосомальной модификации димера, что может приводить к химической неэквивалентности СЕ. Для проявления активности фермента обязательно присутствие ионов двухвалентных металлов. Ш. эффективность при гидролизе РР1 убывает в ряду Мп2МггСо2 ,. Максимальная активность проявляется при 7. Взаимодействие катионов двухвалентных металлов с РРазой было охарактеризовано различными методами КДспектроскопия, термоинактивация ,, тушение флуоресценции ,, потенциометрия с ионселективным электродом , дифференциальная УФспектроскопия ,,,. Было обнаружено, что на СЕ фермента существует два различающихся по сродству к металлу центра связывания, заполнение которых приводит к изменению структуры и активации РРазы. Всего СЕ РРазы может связать четыреиона магния, один из которых присоединяется к белку в составе комплекса с РР или . На основании термодинамических характеристик специфического связывания РРазой двух катионов магния установлено, что присоединение иона метала в центре высокого сродства не вызывает серьезных конформационных изменений в молекуле белка .