Синтез и свойства новых аналогов ДНК, содержащих неприродные межнуклеотидные вставки, реакционноспособные группировки и пептиды

• Автор: Кузнецова, Светлана Александровна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 279 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ПОЛУЧЕНИЕ РЕАКЦИОННОСПОСОБНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ И ФУНКЦИЙ БИОПОЛИМЕРОВ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Алкилирующие производные нуклеиновых кислот.

1.1.1. Получение алкилирующих производных олигонуклеотидов

1.1.1.1. Введение алкилирующих групп по концам олигонуклеотидов

1.1.1.2. Введение алкилирующих групп по гетероциклическим основаниям .

1.1.2. Использование алкилирующих производных нуклеиновых кислот для аффинной модификации биополимеров

1.2. Фотоактивируемые производные нуклеиновых кислот.

1.2.1. Производные нуклеиновых кислот, содержащие азидогруппу.

1.2.1.1. Введение арилазидных групп в нуклеиновые кислоты.

1.2.1.2. Ковалентное присоединение производных НК, содержащих азидогруппы, к биополимерам
1.2.2. Производные нуклеиновых кислот, содержащие галогено или меркаптогруппы.
1.2.2.1. Получение галогено и меркаптопроизводных олигонуклеотидов
1.2.2.2. Использование галогено и меркаптопроизводных олигонуклеотидов для ковалентного присоединения к белкам и нуклеиновым кислотам.
1.2.3. Псораленовые производные нуклеиновых кислот
1.2.3.1. Введение псораленовой группировки в олигонуклеотиды
1.2.3.2. Ковалентное присоединение псораленовых производных олигонуклеотидов к биополимерам
1.3. Содержащие производные нуклеиновых кислот
1.3.1. Методы введения содержащих реагентов в олигонуклеотиды
1.3.2. Ковалентное присоединение содержащих производных олигонуклеотидов к биополимерам
1.4. Перспективы использования реакционноспособных производных нуклеиновых кислот как реагентов для направленной модификации биополимеров i viv
ГЛАВА 2. СИНТЕЗ И СВОЙСТВА НОВЫХ АНАЛОГОВ ДНК, СОДЕРЖАЩИХ НЕПРИРОДНЫЕ МЕЖНУКЛЕОТИДНЫЕ ВСТАВКИ, РЕАКЦИОННОСПОСОБНЫЕ
ГРУППИРОВКИ И ПЕПТИДЫ ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
2.1. Введение остатка рибоуридина в структуру синтетического ДНКдуплекса .
2.1.1. Сравнение эффективности синтеза межолигомерной связи, образующейся с участием цисдиольной группировки, при использовании различных методов лигирования.
2.1.2. Установление природы связи, образующейся с участием цисдиольной группировки.
2.1.3. Взаимодействие ферментов рестрикции и модификации ЕсоИМ и Ша с синтетическим ДНКдуплексом, содержащим остаток рибоуридина в участке узнавания.
2 2. Введение остатков алифатических диаминов и гликолей в сахарофосфатный остов ДНК
2.2.1. Сравнение эффективности химического лигирования при использовании различных методов активации фосфатной группы
2.2.2. Влияние длины углеводородной цепи на эффективность химического лигирования
2.2.3. Физикохимические свойства ДНКдуплексов, содержащих углеводородные мостики вместо одного из нуклеозидных остатков
2.2.4. Использование ДНКдуплексов. содержащих углеводородные мостики, для изучения механизма действия эндонуклеаз рестрикции ЕсоИН и 1v .
2.3. Направленное введение реакционноспособных тризамещенных
пирофосфатных межнуклеотидных группировок в структуру ДНК.
2.3.1. Дизайн и синтез линейных ДНКдуплексов, содержащих тризамещенную пирофосфатную группировку в одной из цепей
2.3.1.1. Получение Оалкиловых эфиров и амидов олигонуклеотидов
2.3.1.2. Изучение закономерностей введения реакционноспособных тризамещенных пирофосфатных групп в структуру линейных ДНКдуплексов. Влияние метода активации фосфатной группы, природы ненуклеотидного заместителя и структуры реакционного узла на эффективность реакции.
2.3.1.3. Свойства линейных ДНКдуплексов, содержащих тризамещенную пирофосфатную группировку внутри одной из цепей.
2.3.1.4. Использование ДНКдуплексов, содержащих тризамещенную
пирофосфатную группировку внутри одной из цепей, для аффинной
модификации эндонуклеазы рестрикции ЕсоРН
2.3.1.5. Зондирование активного центра фактора транскрипции НЫР1 с помощью набора линейных ДНКдуплексов, содержащих Ометилзамещенную пирофосфатную группу в различных положениях участка узнавания
2.3.2. Синтез и свойства ДНКдуплексов, содержащих тризамещенную пирофосфатную группу между комплементарными цепями
2.3.2.1. Выбор исходных ДНКдуплексов
2.3.2.2. Получение и свойства модифицированных олигонуклеотидных зондов .
2.3.2.3. Введение тризамещенной пирофосфатной группировки между цепями ДНКдуплексов. Определение оптимальных условий реакции.
2.3.2.4. Свойства ДНКдуплексов, содержащих тризамещенную пирофосфатную группировку между комплементарными цепями.
2.3.2.5. Перспективы использования ковалентно связанных ДНКдуплексов, содержащих реакционноспособную группировку между цепями.
2.3.3. Синтез и свойства ковалентно замкнутых ДНКдуплексов, содержащих лирофосфатную и тризамещенную пирофосфатную межнуклеотидные группировки.
2.3.3.1. Выбор исходных ДНКдуплексов
2.3.3.2. Синтез ковалентно замкнутых ДНКдуплексов, содержащих пирофосфатную и тризамещенную пирофосфатную межнуклеотидные группировки.
2.3.3.3. Термическая устойчивость ковалентно замкнутых ДНКдуплексов, содержащих пирофосфатную межнуклеотидную группировку
2.3.3.4. Свойства ковалентно замкнутых ДНКдуплексов, содержащих реакционноспособную тризамещенную пирофосфатную группировку.
2.3.3.5. Использование ковалентно замкнутых ДНКдуплексов, содержащих пирофосфатную и тризамещенную пирофосфатную группировки, для исследования ферментов рестрикции и модификации ЗэоП, эндонуклеаз рестрикции Есо1 и ГУЫа и фермента репарации урацилДНК гликозилазы
2.4. Направленное введение реакционноспособных ацилфосфатных
межнуклеотидных группировок в структуру ДНК
2.4.1. Синтез и свойства линейных ДНКдуплексов, содержащих ацилфосфатную межнукпеотидную группировку в одной из цепей.
2.4.1.1. Получение карбоксилсодержащих олигонуклеотидов.
2.4.1.2. Дизайн исходных ДНКдуплексов
2.4.1.3. Введение ацилфосфатных межнуклеотидных групп. Определение оптимальных условий реакции
2.4.1.4. Свойства линейных ДНКдуплексов, содержащих ацилфосфатную межнукпеотидную группировку
2.4.2. Синтез и свойства ковалентно замкнутых ДНКдуплексов, содержащих ацилфосфатную межнукпеотидную группировку
2.4.3. Перспективы использования реакционноспособных ДНКдуплексов, содержащих ацилфосфатные межнуклеотидные группировки.
2.5. Получение ковалентных коньюгатов олигонуклеотидов с пептидами
2.5.1. Синтез и исследование свойств ковалентных коньюгатов триплексообразующих олигонуклеотидов с пептидами, содержащими несколько повторов активного домена фактора транскрипции Р.
2.5.2. Использование ковалентных коньюгатов олигонуклеотидов с пептидами для активации экспресии генов
ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
3.1. Реактивы и материалы
3.2. Приборы и методы
3.3. Общие методики
ВЫВОДЫ.
ЛИТЕРАТУРА


Введение алкилирующих группировок в гетероциклические основания НК может быть осуществлено как в процессе синтеза олигонуклеотидов, так и путем их постеннтетической модификации. Так, Саммертон с соавт. Полученный таким образом реагент 1. Еще один тип алкилирующих реагентов был получен в результате введения в олигонуклеотид модифицированного остатка дезоксиуридина, содержащего в 5положении реакционноспособную группу 2 . Н3СО ОСЫ3 Н НСОСН ССН 2Вг

Полученный таким образом модифицированный нуклеотид 1. ДНКполимеразы I в процессе синтеза олигонуклеотидной цепи. Такой олигонуклеотидиый зонд еше не является алкилирующим реагентом, поскольку группа СПз8СН малореакционноспособна. Для е активации олигонуклеотид обрабатывали бромцианом. Белоусов с соавт. Реакцию модифицированного олигонуклеотида с 2,3,5,6тстрафторфсниловым эфиром хлорамбуцила проводили в безводном ДМСО, используя олигонуклеотид в виде его триэтиламмонийной соли. В качестве алкилирующих реагентов могут выступать также производные азиридинов. Так, в работе для ковалентного присоединения к участкам НК были предложены олигонуклсотидные зонды, несущие А4,у4тгеноцигозин. Я Сз , Тг2 остаток триазола. С и бизелизин с комплементарными комплексами ДНК. С целью повышения эффективности и селективности модификации ДНК подобными препаратами Луктанов с соавт. СС
В результате взаимодействия соединения 1. Я остаток олигонуклеотида. Реакцию проводили в водной среде в присутствии триэтиламина в течение 2 ч. Выход модифицированных олигонуклеотидов составил . НК и белков. При этом, в зависимости от природы алкилирующего реагента, реализуется один из двух основных механизмов нуклеофильною замещения 1 или 2. По механизму 1 реагируют производные олигонуклеотидов, несущие ароматическую 2хлорэтиламиногруппу. И результате внутримолекулярной перегруппировки в этой группе образуется высореакционноспособный этилениммониевый катион
I i
где остаток олигонуклеотида. Этот реакционноспособный промежуточный продукт может реагировать с различными нуклеофильными группами, находящимися в реакционной смеси, том числе с нуклеофильными центрами компонентов буферных растворов, или гидролизоваться водой . Это обстоятельство накладывает существенные ограничения на использование подобных реагентов i viv, где в качестве нуклеофилов могут выступать функциональные группы белков и других макромолекул клеточных структур. Более специфично действуют реагенты, взаимодействующие с нуклеофилами но 2 механизму, такие как производные азиридинов и соединения, содержащие СОСНгНагруппу, а также реагенты, алкилирование которыми требует дополнительной стадии активации. Одним из первых примеров ковалентного присоединения алкилирующих производных олигонуклеотидов к биополимерам была направленная модификация рРНК олигонуклеотидами, несущими концевую ароматическую 2хлорэтиламиногруппу . Было установлено, что составе комплементарного комплекса степень модификации рРНК достигает . РНКмишсиыо степень модификации составляла 1. Направленность алкилирования и локализация ковалентной связи были исследованы Гриневой с соавт. РНКЧа алкилирующим производным тринуклеотида 1. Было установлено, что алкилирование протекает по трем положениям в тРНК, причем ковалентная связь образуется на расстоянии двух нуклеотидных звеньев от ОСфрагмента гринуклеотидной последовательности. Следует отметить, что в данном случае селективность модификации была достигнута при использовании относительно короткой тринуклеотидной адресной части реагента. Исследование зависимости эффективности реакции ковалентного присоединения алкилирующих олигонуклеотидных зондов к ДНК от прочности комплементарного комплекса было проведено в работе . В качестве мишени использовали 2звенную ДНК. Для алкилирования были использованы реагенты типа 1. В случае гексануклеотида модификации не было зафиксировано, как полагают, изза недостаточно прочного комплементарного комплекса реагента с ДНКмишеныо. В остальных случаях при использовании реагента типа 1. ДНКмишени, расположенный на расстоянии двух нуклеотидных остатков от последней комплементарной пары дуплекса, образуемого реакционноспособным олигонуклеотидом и ДНК этот нуклеотид отмечен на модельной схеме.