рН-зависимость элементарных стадий катализа неорганической пирофосфатазой

• Автор: Фабричный, Игорь Павлович
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 108 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений

Введение

Ферментативные механизмы гидролизасинтеза

фосфоангидридной связи обзор литературы

Пирофосфатаза

Обслки
АТРазы

Экспериментальная часть

Материалы
Ферменты
Определение активности пирофосфатазы
Расчет общих концентраций ионов М2, пнрофосфата и фосфата
Математическая обработка результатов
Результаты и их обсуждение
1. Кинетический механизм ингибирования пирофосфатазы дрожжей
фторидионом
1.1 Влияние нона Р на гидролизсингез РР1
1.2. Инактивация УРРазы в равновесии с фосфатом
1.3. Влияние фторидиона на образование связанного с ферментом пирофосфата
1.4. Константы скорости элементарных стадий катализа
2 Влияние замен консервативных остатков активного центра на
функциональные свойства пирофосфатазы дрожжей
2.1. Влияние мутаций на каталитические свойства РРазы
2.2. Взаимодействие мутантных УРРаз с фторндионом
2.3. Ингибирование фторидионом синтеза РР1 ЕРРазон
3. Влияние на константы скоростей элементарных стадий катализа У РРазой
3.1. Кинетика гидролиза РРт в стационарном состоянии
3.2. Константы скоростей элементарных стадий катализа УРРазой
4. Влияние замен , 4 и I на рИзависимость
катализа ЕРРазой
4.1. зависимость к для и 43
4.2. Влияние замены на величину рК, кислотной группы
Заключение
Выводы
Список литературы


Данная работа посвящена изучению роли ноногенных групп на элементарных сталиях катализа пнрофосфатазой и механизма ингибирования фермента фторидионом с целью локализации существенных для катализа молекул воды. Пирофосфатазы специфически гидролизуют и синтезируют пирофосфат, являющийся простейшим представителем семейства полифосфатов. Результатом гидролиза является перенос фосфорильной группы на молекулу воды. Существует большое число других ферментов, катализирующих обратимый перенос фосфорильной группы на воду, но использующих более сложные субстраты, например нуклеозидтрифосфаты. Несмотря на большие различия в размерах, общей топологии и четвертичной структуре, фосфогидролазы имеют некоторые общие элементы структуры, обычно входящие в активный центр i , а. Для катализа фосфогидролазам необходим, как минимум, один ион двухвалентного металла, связанный с атомами кислорода фосфорильной группы. Известны структуры нескольких фосфогидролаз, полученные с высоким разрешением методом рентгеноструктурного анализа, и сравнение предложенных на их основании механизмов катализа может позволить выявить общую стратегию, используемую ферментами для эффективного гидролнзаеннтеза фосфоангидридной связи. В структурном отношении лучше всего исследованы пирофосфатазы, выделенные из пекарских дрожжей 5. Пирофосфатаза лрожжей состоит из двух одинаковых субъединиц с молекулярной массой кДа . Основу третичной структуры мономера составляют слой и баррсльная структура, состоящая из пяти цспей Iiii . Четыре аспнралн окружают баррель и находятся на поверхности субъединицы. Широкий слой состоит из семи цепей и отделен от растворителя аспиралью. На поверхности фермента было обнаружено шесть полостей, наибольшая из которых, диаметром А, представляет собой активный центр, так как в ней связывается нсгидролнзусмый аналог субстрата i Терзян, или две молекулы фосфата вместе с четырьмя ионами . Е. со0, Тут , Ьу4 4, Тгр8 8, РЬс9 9 и Туг 2 1. Остальная часть впадины образована полярными остатками, которые можно разделить на два кластера положительно заряженные остатки Ьув . Аг8 , ЬувШ 2 и Ьув 8 8 и образующие противоположную стенку отрицательно заряженные С1и . С1и , Авр , Ар5 , Авр7 , Авр0 , Ар7 , С1и8 , С1и0 1 и Ар2 2. Аминокислотные остатки отрицательно заряженного кластера играют основную роль в связывании ионов Мл2 рис. Ионы Мл2 можнр разделить на две пары. Мл1 и Мл2, способные сязываться с белком и в отсутствие субстрата, расположены на дне активного центра, отделены от растворителя фосфатными группами и двумя другими ионами Мп2 и взаимодействуют только с фосфатом Р2 рис. Мп1 координируется кислородными атомами Р2 и боковых цепей Аяр5, Аар 0 и Аар 2 по одному атому кислорода от каждого лиганда. В одной из субъединиц две молекулы воды дополняют координацию Мп1 до октаэдрической, тогда как в другой субъединице эти молекулы воды не обнаружены. Мп2 взаимодействует со вторым кислородным атомом остатка Авр 0, служащего таким образом мостиком между Мп и Мп2, и кислородом Р2. Четыре молекулы воды дополняют октаэдрическую координацию Мп2 в одной из субъединиц, в другой субъединиценаблюдается только одна молекула воды. Ионы Мп1 и Мп2 вместе с боковыми цепями остатков лизина и аргинина создают положительно заряженную область связывания двух фосфатных групп в комплексе с двумя другими ионами Мп НейдпЬето ет а. Напдуипуап й а . Вторая пара ионов металла, МпЗ и Мп4 образует мостики между двумя молекулами фосфата. Для МпЗ в обсих субъединицах наблюдается координация типа квадратной пирамиды кроме кислородных атомов двух фосфатов он связан с кислородным атомом карбоксильной группы остатка и и двумя молекулами воды основание пирамиды обращено к растворителю. Мп4 координирован кислородными атомами двух молекул фосфата и карбоксильных групп Аяр7, Азр2. Две молекулы воды координированы Мп4 в одной субъединице и лишь одна в другой. Предполагается, что в действительности все ионы металла имеют октаэдрическое окружение, и вакантные позиции заняты молекулами воды с высоким температу рным фактором, которые нельзя зарегистрировать анализом структу ры. Фосфатные группы взаимодействуют с боковыми цепями остатков аминокислот положительно заряженного и гидрофобного кластеров рис.