Катализируемый субтилизином 72 пептидный синтез в органических растворителях

• Автор: Гетун, Ирина Вячеславовна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 132 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР СЕРИНОВЫЕ ПРОТЕИНАЗЫ В ОРГАНИЧЕСКИХ РАСТВОРИТЕЛЯХ

1.1. Поведение сериновых протсиназ в органических растворителях

1.1.1. Растворимость и активность сериновых протеииаз в органических растворителях

1.1.2. Вторичная структура суспендированного и растворенного в органических растворителях субтилизина

.3. Третичная структура сериновых протеиназ в органических растворителях

1.1.4. Структура активного центра сериновых протеиназ в органических растворителях

1.1.4.1. Геометрия активного центра фермента

.4.2. Сольватация активного центра

1.1.5. Конформационная подвижность сериновых протеиназ в органических растворителях

1.1.6. Влияние воды на активность и конформационную подвижность сериновых протеиназ в органических растворителях
1.1.7. Способы активации ферментов в органических растворителях
1.1.7.1. Активация сериновых протеиназ в присутствии солей
1.1.7.2. Стабилизация сериновых протеиназ в присутствии
аналогов субстрата и краунэфиров
1.1.7.3. Стабилизация сериновых протеиназ в органических растворителях посредством образования гидрофобных ионных пар с поверхностно активными веществами
1.2. Пептидный синтез, катализируемый сериновыми протенназами в органических растворителях.
1.2.1. Ферментативный синтез с использованием
суспендированных сериновых протеиназ
.2. Пептидный синтез, катализируемый сериновыми протсиназами,
солюбилизированными в органических растворителях
1.2.3. Пептидный синтез, катализируемый сериновыми протеиназами, иммобилизованными на органических и
неорганических носителях
1.3. Влияние органических растворителей на специфичность
сернновых протеиназ
1.4. Заключение
П. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
.1. Изучение поведения нативного субтнлизина в полярных органических растворителях
II. 2. Изучение синтетических возможностей субтнлизина,
суспендированного в диоксане и ацетонитриле
.2.1. Синтез в ацетонитриле и диоксане
.2.2. Синтез пнитроанилидов тетрапептидов в ацетонитриле
.2.3. Влияние количества субтилизина на протекание реакций
в ацетопитриле
.3. Солюбилизация субтилизина в полярных органических
растворителях посредством образования комплекса с
II. 3.1. Получение и солюбилизация комичекса субтилизин
II. 3.2. Определение состава комплекса субтилизин
II. 4. Изучение эффективности субтилизина в реакциях
образования пептидной связи
.4.1. Влияние активации карбоксильной группы ацилирующего
компонента на протекание синтеза
.4.2. Синтез тетрапептидов, содержащих в i и положениях остатки , , i, и без защиты боковых
функциональных групп
III. Экспериментальная часть
Материалы и методы
Ш.1. Изучение ферментативных свойств субтилизина,
суспендированного в органических растворителях
III. 1.1. Растворение субтилизина
III. 1.2. Определение активности субтилизина
III. 1.3. Синтезы с низкоконцентрированной суспензией
субтилизина в ацетонитриле
III. 1.3.1. Приготовление низкоконцентрированной суспензии
субтилизина в ацетонитриле
III. 1.3.2. Синтез 2А1аА1аЬеирПА
III. 1.3.3. Препаративный синтез 2А1аА1аЬеирИА
III. 1.3.4. Синтез 2А1аА1а1еиЬеирПА
III. 1.3.5. Препаративный синтез 2А 1аА1аЬеи1еирИА
III. 1.3.6. Синтез 2А1аА1а1еиРЪерМА
III. 1.3.7. Синтез 2А 1аА 1аРИеЬеирИА
III. 1.3.8. Синтез 2А1аА1аРЬеРИерШ
III. 1.4. Синтезы с высококонцентрированной суспензией
субтилизина в ацетонитриле
III. 1.4.1. Конденсация 2А1аА1аОСНз и Н1еирИА
III. 1.4.2. Конденсация 2А1аА1аОСНз и НРИерЫА
Ж 1.4.3. Конденсация 2А1аА1аОСНз и НРИеПН2
1,2. Изучение каталитической эффективности субтилизина
в комплексе с Л7Х9
1.2.1. Получение комплекса БОЗсубтгшизин
III. 2.2. Определение элементного состава осадка комплекса ЗйЗсубтилизин
1.2.3. Солюбилизация комплекса ЗйЗсубтилизин в органических растворителях
1.2.4. Седиментационный анализ
1.2.5. Определение активности комплекса ЗОвсубт ил изин
в органических растворителях
III. 2.6. Синтез пептидов с помощью комплекса ЯИЯсу бт ил изин
1.2.6.1. Синтез 2А 1аА 1а1еиРИерМА 3 в этаноле и изопропаноле
1.2.6.1.1. Изучение зависимости синтеза 2Л1аА1аЬеиРИерШ от времени
III. 2.6.1.2. Изучение зависимости синтеза 2А 1аА 1а1еиРИерЫА от
концентрации комплекса ЗОЯсубтилизин
III.2.6.1.3. Изучение влияния на ход синтеза
активации карбоксильной группы ацилирующего компонента
III. 2.6.1.4. Препаративный синтез в этаноле
III. 2.6.2. Синтез VI
III. 2. б. 3. Синтез V
III.2.6.4. Олигомеризация IIОСНз
ВЫВОДЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Но полученная таким образом информация в большей мере отражает способность фермента к реактивации, чем дает представление об истинном состоянии протеиназы в среде органических растворителей. Поэтому весьма важна разработка новых путей и подходов, позволяющих оценивать активность ферментов в системах органических растворителей с низким содержанием воды в функционирующем состоянии непосредственно в ходе ферментативного процесса. Оценка состояния фермента в неводных средах наиболее адекватно может быть проведена из данных по синтетазной активности протсолитических ферментов. Целью работы являлось изучение каталитических свойств нативного и модифицированного субтилизина в составе комплекса с додецилсульфатом натрия вОЗсубтилизин в реакциях образования пептидной связи в средах полярных органических растворителей. Б8субтилизин в реакциях ферментативного синтеза пептидов в средах полярных органических растворителей. Сериновые эндопептидазы представляют собой хорошо изученный класс протеолитических ферментов, включающий, по меньшей мерс, два семейства химотрипсины и субтилизины. Эти семейства весьма обширны и объединяют протеиназы со значительно различающимися свойствами. Общим для данного класса ферментов является однотипность строения активных центров и сходство механизмов действия . Распространенность, доступность, стабильность, широкая субстратная специфичность сериновых протеиназ создают предпосылки для их эффективного использования в качестве катализаторов образования пептидной связи . Проведение ферментативного катализа в среде с малым содержанием воды или в практически безводных органических растворителях обладает рядом неоспоримых преимуществ. Вопервых, гидрофобные субстраты, слабо растворимые в воде, хорошо растворяются в органических растворителях. Кроме того, гак как большинство ферментов пс растворимо в органических растворителях, их легко выделить из реакционной смеси обыкновенным фильтрованием. Биокаталитические реакторы, использующие неводные растворители, не подвержены бактериальному заражению. В данном литературном обзоре будет рассмотрено поведение и каталитическая эффективность сериновых протеиназ в системах с высоким содержанием полярных и гидрофобных органических растворителей. Поведение сериновых протеиназ в органических растворителях. Трехмерная структура белков поддерживается комплексом невалентных взаимодействий, среди которых основными являются гидрофобные и электростатические. Баланс невалентных взаимодействий в значительной степени определяется свойствами окружающей белок среды. В результате воздействия на белок органических растворителей гидрофобные взаимодействия в его структуре ослабевают, электростатические усиливаются. Помимо внутримолекулярных органические растворители усиливают и мсжмолекулярные электростатические взаимодействия, в результате чего биокатализатор может агрегировать. Основными параметрами, определяющими результат контакта биокатализатора с растворителями, являются природа органического растворителя, содержание воды в системе и природа фермента . Органические растворители различаются по степени влияния на белок. Полярные растворители способны непосредственно воздействовать на фермент, лишая его необходимой для осуществления каталитических функций водной оболочки, в то время как неполярные, не смешивающиеся с водой растворители в большинстве случаев инертны по отношению к биокатализатору в силу пространственного разделения компонентов системы. При умеренном содержании большинства полярных органических растворителей образуются истинные растворы ферментов, т. Для широкого круга ферментов и полярных растворителей было показано, что каталитическая активность остается неизменной вплоть до некоторой критической концентрации растворителя, а инактивация при дальнейшем увеличении доли органической компоненты в системе носит пороговый характер рис. Рис. Зависимость скорости гидролиза ИАсЬТугОЕ, катализируемого ахимотрипсином, от концентрации ацетонитрила в смеси с водой 1 гомогенный раствор каталитически активного фермента 2 область существования неактивного фермента 3 суспензия каталитически активного фермента . О
Ацетонитрил, об.