Получение и сравнительная характеристика рекомбинантного OmpF порина Yersinia pseudotuberculosis и его мутантных форм

• Автор: Сидорова, Ольга Вениаминовна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Владивосток
• Количество страниц: 110 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1 Состав и строение наружной мембраны грамогрицательных бактерий

1.2 Порины наружной мембраны грамотрицательных бактерий.

1.2.1 Общая характеристика

1.2.2 Структура и функция поринов

1.2.3. Использование физикохимических методов для характеристики пространственной структуры поринов

1.3 Получение и свойства рекомбинантных поринов

1.3.1. Экспрессия рекомбинантных белков

1.3.2. Механизмы фолдинга белков.
1.3.2.1. Фолдинг белков i viv
1.3.2.2. Методы рефолдинга белков i vi.
1.3.3. Сайтнаправлснный мутагенез.
1.3.4. Исследование свойств мутантных поринов
1.3.4.1. Потенциалозависимость.
1.3.4.2. чувствительность.
1.3.4.3. Чувствительность к антибиотикам.
1.4. Иммунологические свойства порообразующих белков грамотрицательных бактерий.
1.4.1. Антигенные свойства нативных поринов
1.4.2. Иммунологические свойства нативных поринов
1.4.3. Иммунологические свойства рекомбинантных поринов
2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
2.1 Экспрессия и выделение рекомбинантного порина наружной мембраны
. i.
2.2. Рефолдинг и сборка рекомбинантного порина
2.3 Пространственная структура полученных рекомбинантных белков.
2.4. Функциональная активность рекомбинантных поринов.
2.5. Изучение иммунобиологических свойств рекомбинантного порина
У. i.
2.5.1. Изучение иммуногенной активности РБ1.
2.5.2. Применение рекомбинантного мономера порина в качестве диагностического антигена
2.6. Предсказание антигенных детерминант неспецифических поринов патогенных видов иерсиний и иммунохимическая характеристика соответствующих им синтетических пептидов
2.6.1. Предсказание антигенноактивных участков ОгпрР порина
У рзскошЬсгсиоз.
2.6.2. Предсказание Т и Вклеточных эпитопов неспецифических поринов патогенных видов иерсиний
2.6.3. Иммунохимическая характеристика синтетических пептидов, включающих Т и Вклеточные эпитопы неспецифических поринов патогенных иерсиний
2.7. Получение и характеристика мутантных поринов с делениями наружных петель.
2.7.1. Компьютерное моделировано мутантных форм ОшрР порина
У. рзеисоНЬегсиозБ.
2.7.2.Сайтнаправленный мутагенез
2.7.3. Выделение и рсфолдинг мутантных форм рекомбинантного ОшрР порипа
2.7.4. Пространственная структура мутантных поринов
2.7.5. Функциональная активность мутантных поринов.
2.7.6. Иммунохимическая характеристика мутантных поринов.
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
3.1. Материалы.
3.2. Методы
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Получение рекомбинантного порина ii i и его мутантных форм, несущих делеции участков наружных петель, является актуальной научной задачей. Целью данной работы явилось установление взаимосвязи между отдельными элементами участками наружных петель пространственной и антигенной структуры ОтрР порина из У рьеисоШЬегсиовь и его функциональными свойствами. Экспрессия, выделение и подбор условий рефолдинга рекомбинантного порина. Характеристика пространственной структуры полученных интермедиатов рефолдинга мономера и тримера белка. Изучение порообразующих и иммунобиологических свойств рекомбинантного порина. Апробация возможности его использования в качестве антигена для диагностики псевдотуберкулеза. Расчет антигенных В и Тклеточных эпитопов, входящих в состав аминокислотной последовательности поринов, патогенных для человека иерсиний К рзеисошЬегсиояз, У. У. епегосоШса, и синтез соответствующих этим участкам пептидов. Характеристика синтетических пептидов как иммуногенов и диагностических антигенов. Сайтнаправленный мутагенез белоккодирующего участка отрР гена порина с целью создания экспрессионных конструкций, несущих в себе делеции петельных участков аминокислотной последовательности ОтрР порина У. ШЬегсио88. Экспрессия, выделение и подбор условий рефолдинга мутантных белков. Характеристика пространственной структуры полученных интермедиатов рефолдинга мономера и тримера мутантных поринов. Изучение их функциональных и иммунохимических свойств. Основным структурным компонентом живой клетки являются биологические мембраны, которые поддерживают функциональную целостность клетки и регулируют обменные процессы поступление питательных веществ и выброс метаболитов. Кроме того, они служат для передачи сигналов между различными функционально важными участками клеточной поверхности. Цитоплазма клеток грамотрицательных бактерий защищена от окружающей среды 2мя мембранами внутренней цитоплазматической и наружной. Средний слой, неплотно прилегающий к внутренней мембране, представляет собой специфический биополимер, называемый пептидогликаном ПГ, который обеспечивает жесткость клеточной стенки микроорганизма 1 рис. Помимо этого, мембраны связаны между собой видимыми в электронный микроскоп зонами адгезии, или зонами контакта всего в клетке существует 00 таких зон. Столь сложное строение клеточной стенки вызвано условиями обитания грамотрицательных бактерий. Чаще всего это гипотоническое окружение, способное вызвать лизис цитоплазматической мембраны. Рис. В состав наружной мембраны НМ грамотрицательных бактерий входят белки, фосфолипиды и липополисахарид ЛПС. ЛПС, занимающий около поверхности ИМ бактерий, является специфическим компонентом. По своей химической природе ЛПС представляет собой амфифильную молекулу, содержащую гидрофобный липидный компонент и гидрофильную полисахаридную часть. Б НМ бактерий ЛПС прочно, но не ковалентно связан с некоторыми белками в частности, с поринами 2. В НМ, по сравнению с внутренней, обнаружен небольшой набор белков, содержание которых достаточно велико. Прежде всего, это интегральные каналообразующие белки, которые обеспечивают поступление в клетку питательных веществ, а, возможно, и выброс продуктов жизнедеятельности, поскольку в соответствии с химической природой составляющих ее липидов НМ малопроницаема для гидрофильных веществ. Порообразующие белки, представляющие собой своеобразную транспортную систему, были открыты в году 3. С тех пор термин порины стал использоваться для обозначения целого класса белков, образующих в НМ диффузионные каналы для осуществления неспецифического транспорта небольших гидрофильных молекул, участвующих в метаболизме бактерий. Впоследствии порины были обнаружены во всех исследованных видах грамотрицательных бактерий 4. Порины наружной мембраны грамотрицательных бактерий. На протяжении нескольких десятилетий классической моделью для изучения порообразующих белков служит кишечная палочка ii i. Показано, что в клетках этой 1рамотрицательной бактерии синтезируется несколько типов поринов , , и . Первые три типа белков являются основными в количественном отношении 5.