Разработка метода доставки в клетки пептидо-нуклеиновых кислот в составе их композитов с наночастицами диоксида титана

• Автор: Амирханов, Ринат Нариманович
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 110 с. : ил.

Содержание

Список сокращений

Введение
Глава 1. Наночастицы и наноконструкции как транспортёры нуклеиновых кислот (обзор литературы)

1.1. Органические наночастицы

1.1.1. Методы получения органических наночастиц

1.2. Неорганические наночастицы

1.2.1. Методы получения неорганических наночастиц

1.2.2. Способы модификации поверхности неорганических наночастиц

1.3. Визуализация наночастиц и наноконструкций на их основе

1.4. Взаимодействие наночастиц с эукариотическими клетками

1.4.1. Влияние наночастиц на жизнеспособность эукариотических клеток
1.4.2. Защита нуклеиновых кислот наночастицами от действия нуклеаз
1.4.3. Транспорт наночастиц, содержащих НК и другие препараты, в эукариотические клетки и
их биологический эффект после доставки
1.5. Проблема эффективного выхода НК, доставленных в клетки, из эндосом
1.6. Выход НК и других соединений из состава комплекса с наночастицами
1.7. Проблемы адресной доставки наночастиц с НК к клеткам-мишеням
Заключение к обзору литературы
Глава 2. Материалы и методы
2.1. Приготовление 0.2 мМ раствора полилизина в воде
2.2. УФ-спектрометрия ДНК и ГТНК олигонуклеотидов
2.3. Флуоресцентная спектрометрия ПНК олигонуклеотидов
2.4. Обращённо-фазовая ВЭЖХ ПНК олигонуклеотида
2.5. Обращённо-фазовая ВЭЖХ ДНК олигонуклеотида
2.6. Получение ДНК и ПНК олигонуклеотидов
2.7. Введение радиоактивной метки в ДНК олигонуклеотид
2.8. Введение флуоресцентной метки в ПНК олигонуклеотид
2.9. Получение ДНК/ДНК и ДНК/ПНК дуплексов
2.10. Получение комплексов ДНК/ДНК и ДНК/ПНК дуплексов с полилизином

2.11. Термическая денатурация свободных ДНК/ДНК и ДНК/ПНК дуплексов и их комплексов с
полилизином в растворе
2.12. Измерение оптического поглощения смеси ДНК/ДНК или ДНК/ПНК дуплексов и их
комплексов с полилизином в зависимости от времени
2.13. Получение наночастиц диоксида титана
2.14. Получение наночастиц диоксида титана, покрытых полилизином
2.15. Иммобилизация одноцепочечной ДНК на ТЮ2"РЬ композитах
2.16. Иммобилизация ДНК/ПНК дуплекса на ТЮг'РЬ композитах
2.17. Исследование температурной зависимости десорбции ПНК из ТЮг'РЬ*ДНК/ПНК нанокомпозита
2.18. Исследование временной зависимости десорбции ПНК из ТЮг'РЬ* ДНК/ПНК нанокомпозита
2.19. Оценка выживаемости клеток МЭСК с помощью МТТ реагента
2.20. Исследование способности ТЮг'РЬ* ДНК/ПиПНК нанокомпозита проникать в клетки НеЬа
с помощью конфокальной лазерной флуоресцентной микроскопии
2.21. Исследование способности ТЮг'РЬ* ДНК/ПНК нанокомпозита проникать в клетки МЕ>СК
с помощью проточной цитофлуорометрии
2.22. Противовирусная активность ТЮг’РЬ*ДНК/ПНК нанокомпозитов
Глава 3. Результаты и обсуждения
3.1. Синтез ПНК
3.2. Синтез ПНК-олигомера (р|иПНК), содержащего флуоресцентную метку
3.3. Комплексообразующие свойства синтезированного олигомера ПНК
3.4. Синтез и характеризация наночастиц диоксида титана
3.5. Иммобилизация ПНК в составе ДНК/ПНК дуплекса на наночастицах ТІО2, покрытых
полилизином
3.5.1 Оптимизация условий иммобилизации ДНК на наночастицах ТЮг, покрытых
полилизином
3.5.2. Структуры ТіОг'РЬ композитов в зависимости от мольного соотношения РІЛ1О
3.6. Влияние полилизина на диссоциацию ДНК/ДНК и ДНК/ПНК дуплексов в физиологическом
растворе
3.6.1. Влияние полилизина на термическую денатурацию ДНК/ДНК и ДНК/ПНК дуплексов
3.6.2. Влияние полилизина на диссоциацию ДНК/ДНК и ДНК/ПНК дуплексов с течением времени

3.6.3. Возможные структуры комплексов, образуемых полилизином с ДНК/ДНК и ДИКУШ [К дуплексами
3.7. Диссоциация ДНКУПНК дуплексов, иммобилизованных на наночастицах ТЮг, покрытых
полилизином. Зависимость от температуры
3.8. Диссоциация ДНК/ПНК дуплексов, иммобилизованных на наночастицах ТЮ2, покрытых
полилизином. Зависимость от времени
3.9. Исследование влияния нанокомпозитов ТЮг'РЬ* ДНК/ПНК на жизнеспособность
эукариотических клеток
3.10. Способность ТЮг'РЬ*ДНК/ПНК нанокомпозитов проникать в эукариотические клетки
3.11. Испытание биологической активности ТЮг'РЬ*ДНК/ПНК нанокомпозитов на примере
клеток МБСК, инфицированных вирусом гриппа А/А1сЫ/2/68 (Н31Ч2)
Выводы
Список литературы

Fe3(VPEI- БАтпсДНК 10.4 (общий 64) MCF-7, клетки рака груди человека Показано окраской с помощью берлинской лазури накопление наночастиц в цитоплазме. [68]
РезСДтюдика- тион*рДНК Общий 13-34 Hep G2, клетки рака печени человека Доставка ДНК плазмиды, кодирующей р-галактозидазу. Исследовали эффективность трансфекции, анализируя активность Р-галактозидазы. Показано, что воздействие магнитного поля повышает эффективность трансфекции. [70]
FejCU’PEG* (РА, или PL, или PEI>siPHK 12 С6, рак мозга; MCF-7, рак груди; ТС2, рак простаты Показано уменьшение эффективности экспрессии GFP на 30-80% в зависимости от типа клеток, выражающееся в снижении интенсивности флуоресценции, нормированной на число выживших клеток. [72]
Au-siPHK 13 HeLa Показано уменьшение активности Firefly люциферазы в присутствии наночастиц на 73%, а в присутствии свободной siPHK на 33%. Уровень контрольной Renifla люциферазы не изменялся. [21, 82]
Au-NH3+- РДНК 1.4 (общий 200-600) С2С12, мышиные миоблас- ты Доставка ДНК плазмиды, кодирующей мышиный интерлейкин 2. С помощью ПЦР в реальном времени, показано, что при доставке с помощью наночастиц уровень шРНК в 6.4 раза выше по сравнению с доставкой PEI (25 кДа), а иммуноферментным анализом показано, что экспрессия белка интерлейкина 2 в 3.2 раза выше. Наблюдали концентрационную зависимость, выражающуюся в увеличении экспрессии шРНК интерлейкина 2 при увеличении количества siPHK, иммобилизованной на наночастицах. [17]
Аи'рДНК* Lipofectamine- 2000 15, 30, 50, 80 А549, клетки рака лёгких человека Использовали ДНК плазмиду, кодирующую GFP. Доставка рДНК в составе Au*p)]FrK*Lipofectamme-2000 в 1.5-4 раза, чем в составе p)lHK,Lipofectamine-2000. Выживаемость клеток при трансфекции с наночастицами составила 80-100%, с липофектамином -40%. [19]
Au*DODAB* РДНК 14 НЕК 293 Использовали ДНК плазмиду, кодирующую GL3 люциферазу. С помощью сканирующей электронной [83]