Методология получения модифицированных олигодезоксирибонуклеотидов для создания эффективных инструментов молекулярно-биологических исследований

• Автор: Абрамова, Татьяна Вениаминовна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 400 с. : 11 ил.

Введение

Глава I. Синтез олигодезоксирибонуклеотидов и их производных обзор литературы

1. Основные проблемы при синтезе природных олигодезоксирибонуклеотидов и пути их решения

1.1 Основные этапы развития методов образования межнуклеотидной связи

1.2 Совершенствование фосфотриэфирного метода синтеза олигодезоксирибонуклеотидов

1.3 Крупномасштабный синтез олигодезоксирибонуклеотидов природного строения

1.3.1 Разработка методов быстрого деблокирования олигомеров

1.3.2 Параллельный синтез олигонуклеотидов

1.3.3 Препаративные синтезаторы ДНК 3

1.3.4 Синтез олигодезоксирибонуклеотидов на растворимых полимерах

1.4 Заключение к разделу 1 главы I

2. Дизайн и синтез модифицированных олигонуклеотидов, их аналогов и миметиков нуклеиновых кислот
2.1 Методы модифицирования олигонуклеотидов по концам олигомеров
2.2 Методы модифицирования олигонуклеотидов по гетероциклическим основаниям
2.2.1 Модифицирование пиримидиновых гетероциклов нуклеозидов
2.2.2 Модифицирование пуриновых гетероциклов нуклеозидов
2.2.3 Нуклеозиды с неприродными гетероциклическими
основаниями
2.3 Олигонуклеотиды с модифицированными связями линкером между нуклеозидами
2.3.1 Отрицательно заряженные аналоги олигонуклеотидов
2.3.2 Неионные аналоги олигонуклеотидов
2.3.3 Положительно заряженные аналоги олигонуклеотидов
2.4 Олигонуклеотиды с модифицированным углеводным фрагментом
2.4.1 2 ОМодифицированные олигонуклеотиды
2.4.2 Мостиковые нуклеиновые кислоты
2.5 Олигонуклеотиды с модифицированными как углеводным, так и линкерным фрагментами
2.5.1 Отрицательно заряженные пептиднонуклеиновые кислоты
2.5.2 Конформационноограниченные пептиднонуклеиновые кислоты, в том числе протонируемые
2.5.3 Другие замещенные производные пептиднонуклеиновых кислот, в том числе положительно заряженные
2.5.4 Морфолиновые аналоги олигонуклеотидов
2.6 Заключение к разделу 2 главы 1
Глава II. Результаты и обсуждение
1. Разработка метода получения 5фосфорилированных защищенных мономеров для синтеза олигодезоксирибонуклеотидов триэфирным методом в растворе
1.1 мХлорфенил2цианоэтил5,фосфоЛациллевулинил
дезоксинуклеозиды
1.2 Заключение к разделу 1 главы II
2. Препаративный синтез олигодезоксирибонуклеотидов
2.1 Универсальный протокол триэфирного метода синтеза олигодезоксирибонуклеотидов с использованием бфосфорилированных нуклеотидов в препаративных количествах
2.2 Заключение к разделу 2 главы II
3. Дизайн и разработка методов синтеза модифицированных
олигодезоксирибонуклеотидов и их аналогов
3.1 Модифицирование олигодезоксирибонуклеотидов по концам олигомеров
3.2 Разработка подходов к модифицированию
олигодезоксирибонуклеотидов по гетероциклическим основаниям
3.3 Разработка подходов к модифицированию олигонуклеотидов по
углеводным остаткам
3.4 Модифицирование олигодезоксирибонуклеотидов по межнуклеотидной фосфатной группе
3.5 Морфолиновые аналоги олигонуклеотидов
3.5.1 Морфолидооксалиламидные аналоги олигонуклеотидов
3.5.2 4 Метиленкарбоксамидные морфолиновые аналоги
олигонуклеотидов
3.6 Заключение к разделу 3 главы II
4. Разработка подходов к обратимому модифицированию
о л и год езо кс и р и бо ну кл еоти д о в
4.1 Фотолабильные линкеры
4.2 Блокированные фотолабильными остатками по межнуклеотидной
фосфатной группе олигодезоксирибонуклеотиды
4.3 Заключение к разделу 4 главы II
5. Дизайн и синтез 5трифосфатов природных и модифицированных динуклеотидов и модифицированных нуклеозидов
5.1 Введение 5трифосфатного фрагмента в динуклеотиды
постсинтетически
5.2 Введение 5три фосфатного фрагмента в процессе синтеза динуклеотидов
5.2.1 5Трифосфаты динуклеотидов
5.2.2 Трифосфаты морфолиновых нуклеозидов
5.3 Заключение к разделу 5 главы II
Глава III. Экспериментальная часть
1. Реактивы и приборы
2. Методики синтеза соединений и методы исследования
2.1 Методики синтеза соединений и методы исследования к разделу 1 главы II
2.2 Методики синтеза соединений и методы исследования к разделу 2 главы II
2.3 Методики синтеза соединений и методы исследования к разделу 3 главы II
2.3.1 Получение олигодезоксирибонуклеотидов, модифицированных по концам олигомеров
2.3.2 Получение мономерных синтонов для синтеза олигодезоксирибонуклеотидов, модифицированных по
гетероциклическим основаниям
2.3.3 Получение мономерного синтона для синтеза олигонуклеотидов, модифицированных по углеводному остатку
2.3.4 Получение олигодезоксирибонуклеотидов, модифицированных по фосфатной группе
2.3.5 Получение морфолиновых аналогов олигонуклеотидов
2.4 Методики синтеза соединений и методы исследования к разделу 4 главы II
2.5 Методики синтеза соединений и методы исследования к разделу 5 главы II
Заключение
Выводы
Благодарности
Список литературы


Уменьшение веса может достигать 1 на цикл, увеличиваясь к концу синтеза, когда размер синтезированного олигонуклеотида становится сравнимым с размером молекул подложки. Как было отмечено ранее, проведение синтеза в растворе плохо поддается автоматизации, что делает процедуру синтеза длительной и дорогостоящей. Для синтеза на растворимых полимерах методом авторам удалось создать автоматический синтезатор 8. В работах 9, 0 было предложено присоединять первый с Зконца нуклеотидный синтон к , служившему носителем, через фосфатную группу без промежуточного линкера. Фосфодиэфирная связь между олигонуклеотидом и стабильна в условиях деблокирования. В результате по окончании синтеза получали , конъюгированные с , без дополнительных стадий синтеза. Конъюгирование с в ряде случаев существенно улучшает фармакологические свойства 1. Приведенные в настоящем разделе данные свидетельствуют, что за последние лет синтез олигодезоксирибонуклеотидов превратился в коммерческое производство. Существует множество компаний, специализирующихся на олигонуклеотидном синтезе. Все это стало возможным в результате бурного развития химии нуклеиновых кислот во второй половине прошлого века. Существенный вклад в изучение механизмов образования межнуклеотидной связи в ходе изучения различных подходов к синтезу СМЫ внесли сотрудники НИБХ СО РАН ранее НИОХ СО АН, в настоящее время ИХБФМ СО РАН из лабораторий академика РАН Д. Г. Кнорре, а позднее д. В. Ф. Зарытовой. Фундаментальные исследования, проведенные под руководством этих ученых, позволили создать вариант синтеза фосфорилированных ОсГЫ с помощью триэфирного метода, как в растворе, так и на твердофазном носителе. Как будет показано в следующих разделах, 5фосфатная группа в Ос1Ы является удобным местом модифицирования олигонуклеотидов. Кроме того, наличие 5фосфата необходимо для лигирования коротких ДНКдуплексов в более протяженные конструкции гены. Недавно предложен так называемый тандемный подход, который позволяет получать смеси 5фосфорилированных МЫ, пригодных для ферментативного лигирования, в одном синтезе 5. В данном разделе рассмотрены только основные, принципиальные на наш взгляд вопросы синтеза природных Ос1К Можно заметить, что в последние лет сравнительно мало было сделано в области развития методов образования межнуклеотидной связи при синтезе природных олигонуклеотидов 4, в то же время значительные усилия были направлены на автоматизацию процесса, поиск новых защитных групп, повышение экономичности синтеза. ПЦР, секвенирование и связанной с этим потребностью в большом числе разнообразных праймеров. В настоящее время основные усилия в области синтеза ОбЫ сосредоточены на совершенствовании технологии производства ДНКчипов для диагностики 6, 7. Производство ДНКчипов весьма экономично, однако количество ОсМ, которые могут быть получены таким образом, очень мало около фемтомоль 8, а качество продуктов часто недостаточно для последующей ПЦР. Для заполнения промежутка между сверхмалым количеством ОсНМ, синтезируемым по чиповой технологии, и количеством ОсИ, получаемом на коммерчески доступных планшетных синтезаторах нмоль, ведутся работы по конструированию так называемых микропотоковых гшсгоАшсйс олигонуклеотидных синтезаторов 9, 0. С помощью таких приборов можно синтезировать 0 пмоль ОсШ с достаточно высоким качеством, при этом процесс отличается высокой экономичностью 1. В работе 2 возможности нового подхода продемонстрированы на примере экономичного расход реагентов уменьшен в 0 раз параллельного синтеза Ос1П и последующей успешной сборкой двуцепочечной ДНК длиной 0 пар звеньев с помощью лигазы без предварительной очистки и промежуточной амплификации получаемых фрагментов. К сожалению, несмотря на многолетние клинические испытания более различных последовательностей природных ОН и их аналогов, только одно соединение Укгауепе одобрено к настоящему времени в качестве терапевтического средства . Этот факт, несомненно, сдерживает исследования по разработке и внедрению в практику процессов по крупномасштабной килограммов наработке ОсГЫ и их аналогов.