Роль фактора элонгации EF-G в процессах транслокации и рибосомного рециклинга

• Автор: Гаврилюк, Василий Васильевич
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 97 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ТРАНСЛЯЦИОННЫЕ ГТФАЗЫ. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Общие свойства ГТФаз

Структурные элементы рибосомы, участвующие в регуляции активности

трансляционных ГГФаз

ГТФазы трансляционного аппарата прокариот

Инициация.

Элонгация и транслокация

Терминация

ГЛАВА И. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Исследование механизма действия элонгационного фактора ЕГС в транслокации

Исследование транслокации методом токсинзависимого разрезания мРНК в
рибосом ном Аучастке.
Сравнительный анализ пре, посттранслокационного и промежуточного
состояний рибосомы
Исследование обратимости образования в переходного состоянияпри
связывании ЕРССОР с претранслокационным комплексом.
Исследование аффинности деацилированных тРНК к Еучастку рибосомы. Анализ чистоты используемых в лабораторной практикенуклеотидов роль
примесей результатах измерений
Рибосома СЕР для ЕРб
Обсуждение результатов 1
Исследование механизма действия трансляционных факторов ЕРв и Я в
рибосомного рециклинга.
Исследование роли дисоциации тРНК с посттерминационногокомплекеа в
механизме реинициации.
Роль контактов между Б рРНК и последовательностью ШайнДальгарнопри реинициации трансляции
Теримнацинные факторы не транслоцируют связанную в Ручастке
постгерминационного комплекса мРНК
Роль и в диссоциации деацилированой тРНК с рибосомы
стимулирует связывание с и понижает с
Диссоциация на субъединицы под действием и .
Обсуждение полученных результатов II
ГЛАВА III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
Использованные препараты и компоненты системы для белкового синтеза i vi
Использованные методы
Препаративное выделение рибосом с использованием зонального ротора i
Очистка нуклеотидов , и .
Экспрессия и очистка .
Экспрессия и очистка нативного
Экспрессия и очистка I2
Экспрессия и очистка тРНК.
Метод токсинзависимого разрезания мРНК в рибосомном Аучастке
Исследование диссоциации РтР1 ГК111 с претранслокационного комплекса
Исследование диссоциации 3Н 4I из рибосомного комплекса под
действием пуромицина
Исследование связывания , и с .
Исследование связывания тРНК с рибосом ным Еучастком.
Ультрацентрифугирование рибосомных комплексов в сахарозных градиентах
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА


Очистка нуклеотидов , и . Экспрессия и очистка . Экспрессия и очистка тРНК. Исследование связывания , и с . Исследование связывания тРНК с рибосом ным Еучастком. Рибосома молекулярная машина, синтезирующая белки согласно информации об их первичной структуре, заложенной в нуклеотидной последовательности мРНК 1. В процессе синтеза белка, который с химической точки зрения представляет собой полимеризацию аминокислот в полипептидную цепочку, принимают участие кроме рибосомы дополнительные молекулы. Вопервых, РНК, выполняющие следующие функции а кодирования аминокислотной последовательности будущего белка мРНК, б адаптера, приносящего в химически активированной форме аминокислоты и устанавливающего взаимнооднозначное соответствие трехбуквенному коду азотистых оснований код аминокислотной последовательности тРНК, в регуляторные функции тмРНК, малые РНК. Вовторых, важную роль в биосинтезе белка играют малые молекулы, такие как нуклеотиды АТР и , аминокислоты, различные ионы. Втретьих, в процессе трансляции принимаю участие белковые молекулы аминоацилтРНКсинтетазы, трансляционные факторы, а также многочисленные вспомогательные белки трансляционного аппарата, выполняющие различные регуляторные функции. Часть трансляционных факторов обладает ГТФазной активностью см. Гидролиз этими белками происходит на определенных стадиях белкового синтеза, и напрямую сопряжен со связыванием факторов с рибосомой, находящейся в определнном функциональном состоянии. В клетке . I2, инициаторный фактор, приносящий на рибосому инициаторную 4, элонгационные факторы и , ответственные за транслокацию и связывание новой тРПК в участке рибосомы соответственно 58, а также терминационный фактор 3, функция которого заключается в освобождении другого терминационного фактора, 1 или 2 с посттерминациониого рибосомного комплекса 59. Таким образом, ГТФазы принимают участие во всех этапах белкового синтеза. В связи с этим невозможно переоценить значение понимания общих закономерностей, присущих ГТФазам, для понимания механизма трансляции в целом. Исследование механизма действия конкретных ГТФаз позволяет найти общие черты, присущие этим белкам, что в свою очередь служит базой для исследования механизма действия менее изученных представителей семейства. В этом смысле весьма полезно исследование хорошо разработанной i vi системы трансляции Е. В данной работе исследовали механизм действия элонгационного фактора Е. Кроме исследования механизмов действия были исследованы сопредельные проблемы механизмов трансляции. ГЛАВА I. ТРАНСЛЯЦИОННЫЕ ГТФАЗЫ. Общее свойство ГТФаз как следует из названия этого семейства белков способность гидролизовать , причем гидролиз нуклеотида приводит к функциональным перестройкам в белке, см. В семейство ГТФаз входят различные белки, в том числе подобные ГТФазы, ГТФазы, входящие в состав гетородимерных Гбелков субъединицы, трансляционные факторы и другие. Общий цикл действия ГТФаз заключается в переходе из неактивного состояния в комплексе с путем обмена нуклеотида в активное связанное состояние, после чего белок гидролизует нуклеозидтрифосфат и возвращается в исходное состояние. Структура и связанных форм обычно различна, и белок, таким образом, работает наподобие молекулярного переключателя, переходя из одной конформации в другую посредством замены нуклеотида , . Изменение же структуры белка может передавать сигнал на молекулу, с которой ГТФаза находится в комплексе, например, в случае трансляционных факторов, на рибосому, вызывая в ней конформационные изменения. В цикле действия ГТФаз оба этапа замены нуклеотида могут подвергаться регуляции. Так, фактор, ускоряющий обмен на , называется обменивающий фактор, x , . Фактор, вызывающий усиление гидролизной активности ГТФазы называется активатор ГТФазной активности, ivi i, , рис. Классический механизм действия в процессе обмена на заключается в том, что, связываясь с ГТФазой, он понижает е сродство к , ослабляя контакты белка со связанным нуклеотидом, после чего диссоциирует, и его место может занять .