Взаимодействие негистонового хромосомного белка HMGB1 с ДНК, роль ДНК-связывающего и С-концевого доменов HMGB1 в формировании ДНК-белковых комплексов

• Автор: Поляничко, Александр Михайлович
• Шифр специальности: 02.00.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 182 с. : ил

Оглавление.
Введение.

Глава 1. Обзор литературы

1. Современные представления о структуре хроматина.

1.1. Нуклеосомная организация хроматина.

1.2. нм фибриллы.

1.3. Высшие уровни структурной организации хроматина

2. Негистоновые белки хроматина семейства 1I1.

2.1. Белки семейства 12

2.2. Структура белка 1 .

2.3. Белки, содержащие домены

2.4. Расположение в хроматине и взаимодействие с ДНК
2.5. Функции белков, содержащих домены.
Глава 2. Методы исследования и .материалы.
1. Аналитическое ультрацентрифугирование.
1.1. Расчет коэффициента седиментации
1.2. Методика эксперимента.
2. Спектроскопия ультрафиолетового диапазона
2.1. УФспектроскопия.
2.2. Спектроскопия кругового дихроизма
2.2.1. Определение структуры полипептидов по спектрам КД
2.2.2. Определение структуры ДНК на основе анализа спектров КД.
2.2.3. Методика эксперимента
2.3. Флуоресцентная пектроскопия
3. Спектроскопия инфракрасного диапазона
3.1. ИКспектроскопия
3.2. Вибрационный круговой дихроизм.
3.3. Применение ИК спектроскопии в исследовании структуры биополимеров
3.3.1.Определение структуры полипептидов
3.3.2.0ирсделение структуры нуклеиновых кислот
3.3.2.1. Колебания аминогруппы оснований
3.3.2.2. Колебания кратных связей в основаниях
3.3.2.3. Колебания сахарофосфатного остова
3.3.3.Методика эксперимента.
4. Сканирующая силовая микроскопия.
5. Получение препаратов и формирование искусственных комплексов
5.1. Выделение плазмидной ДНК
5.2. Получение белков
5.3. Формирование ДНКбелковых комплексов
Глава 3. Комнактизация ДНК при взаимодействии с пегиетоновым белком НМСВ1.
1. Седиментация и оптическая активность комплексов рДНКНМОВ1 .
2. Комплексы белка НМСВ1 с высокомолекулярной ДНК
2.1. Оптическая активность комплексов ДНКН1УЮВ1
2.2. Флуоресцентные свойства ДНКбелкового комплекса.
2.3. Колебательные спектры комплексов ДНКНМвВ 1
2.4. Визуализация комплексов методом ССМ.
3. Выводы к главе 3
Глава 4. Влияние ионов металлов на комнактизацшо комплексов НхМСВЬДНК.
1. Введение
2. Действие ионов кальция на свойства ДНКбелкового комплекса
2.1. Комплексы Са2ДНК
2.2. Комплексы НМСВ1ДНКСа2 .
3. Ионы марганца.
3.1. Комплексы Мп2ДНК
3.2. Комплексы НМСВЬДНКМп
3.3. Заключение.
4. Выводы к главе 4
Глава 5. Взаимодействие ДНК с рекомбинантным белком НМС1АВ.
5.1. Взаимодействие НМАВДНК в условиях различной ионной силы.
5.1.1. Низкая ионная сила мМС1
5.1.2. Высокая ионная сила 0 мМ КаС1.
5.1.3. Заключение
5.2. Влияние ионов Са2 на формирование высокоупорядоченных комплексов
5.3. Заключение.
5.4. Выводы к главе 5.
Глава 6. Взаимодействие 1 с ДНК в присутствии гистона .
6.1. Введение
6.2. Взаимодействие ДНК с белками 1 и Н1 в растворах мМ
6.3. Поведение ДНКбелковых комплексов в присутствии ионов Мп2
6.3.1. Оптическая активность тройного комплекса
6.3.2. Характеристика колебательных переходов системы ДНКИ1 1 Мп2
6.3.3. Обсуждение
6.4. Выводы к главе 6.
Заключение
Выводы
Список литературы


Вариации нуклеосомного повтора в разных типах клеток связаны с изменением размеров линкерного участка ДНК, что было показано путм обработки хроматина микрококковой нуклеазой. Размер линкерного участка ДНК определяет доступность хроматина для различных взаимодействий. Доступность ДНК в неактивном хроматине падает с увеличением содержания гистона Н1, даже в тех случаях, когда даблюдается одновременный рост длины линкерного участка ДНК подробнее см. Доступность ДНК является ключевым фактором, определяющим функциональную цстивность хроматина. Возможно, что это является одной из причин, по которой определение нуклеосом вдоль молекулы ДНК является неоднородным. В составе хроматина были выделены области, обладающие повышенной чувствительностью к 1ействию ДНКазы I, что свидетельствовало о наличии достаточно протяжнных участков ЩК, свободных от нуклеосом . Справедливо и обратное, взаимодействие с скоторыми негистоновыми белками может репятствовать формированию коровой частицы. Как удет обсуждаться ниже, такие бсзнуклеосомные нтервалы могут играть важную роль в формировании ысших уровней организации хроматина. Рисунок 3. АТконтакты ДНК с нуклеосомой. ДНК . Как уже отмечалось выше, образование коровой частицы сопряжено с существенным изгибом двойной спирали. Этот процесс серьзно осложняется необходимостью сжатия малой бороздки ДНК. В силу того, что малые бороздки АТбогатых последовательностей легче сжимаемы, чем ГЦбогагые, возникает предпочтительное расположение АТпар таким образом, чтобы они своими малыми бороздками были обращены к гистоновому октамеру, а малые бороздки ГЦпар были обращены наружу нуклеосомной частицы рисунок 3. Благодаря взаимодействию иежду собой, в живой клетке соровые частицы не остаются в зиде бусин на нитке, а збразуют болсс плотную упаковку ,. Важную роль в образовании и стабильности фибриллы играют гистоны семейства Н1. Молекула линкерного гистона обладает консервативным глобулярным ядром, связанным с менее консервативными С и Ыконцевыми плечами 1. Связываясь в определнном месте с нуклеосомной частицей, Н1 присоединяется вытянутыми плечами к соседним коровым частицам, стягивая их в регулярные массивы. Нуклеосомные частицы образуют при этом плотную суперспираль, диаметром нм рисунки 4, 5 . Взаимодействие гистона Н1 с ДНК носит выраженный кооперативный характер т. Связываясь с ДНК, Н1 формирует кластеры по 8 и более молекул. Рисунок 4. ДНК. В таком случае конденсациядеконденсация такого участка фибриллы происходилабы по принципу вс или ничего, позволяя регулировать активность небольших областей хроматина рисунок 8. Интересно отметить, что связывание Н1 с ДНК не всегда носит кооперативный характер. Для его возникновения необходима либо соответствующая ионная сила раствора не менее мМ ЫаС1, либо высокое соотношение белокДНК в системе 1. Более подробно этот вопрос рассмотрен в обзоре 4. IЛ Л1
Рисунок 6. Модели построения соленоида и зигзага . Й сегмент хроматина из эритроцитов цыплят по данным наблюдений в 5 мМ С1. Ь конструкция олигонуклеосомного фрагмента из хроматина эритроцитов цыплят по данным наблюдений в мМ 1. Модели организации фибрилл, построенные по методу средних углов на входевыходе зуклеосомы на основе прямых наблюдений. Углы составляют I, II и III. Пространственные модели нуклеосомы с учтом различных топологических параметров. Рисунок 7. Спиральная А и зигзагообразная В укладка нуклеосом в фибриллу . Рисунок 8. Нуклеосомные кластеры в составе фибриллы. Высшие уровни структурной организации хроматина являются наиболее авораживающими, но вместе с тем и наименее изученными. Хотя их молекулярные геханизмы до сих пор остаются загадкой, уже сейчас можно сказать, что они играют важную оль в регуляции транскрипции генов. По имеющимся на сегодняшний день данным, нм фибрилла является далеко не оследним уровнем структурной организации. Принято считать, что следующей стадией паковки хроматина становится выпетливание фибриллы. О возможности такого устройства зидетельствуют следующие данные. После специальной обработки, а также в клетках екоторых насекомых, можно увидеть, что хромосомы состоят из довольно больших петель роматина рисунок 9.