Иммобилизация уреазы на поверхности органокремнеземов и свойства полученных препаратов

• Автор: Любинский, Георгий Вадимович
• Шифр специальности: 02.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Киев
• Количество страниц: 166 c. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ

Общая характеристика работы .

Глава I. Обзор литературы.

1.1. Иммобилизованные ферменты .

1.2. Роль диффузии в катализе иммобилизованными ферментами .

1.3. Уреаза и ее использование в аналитической химии.

1.4. Кинетика иммобилизации ферментов .

Глава 2. Материалы и методы .

2.1. Синтез носителей для иммобилизации ферментов

2.2. Иммобилизация уреазы и исследование ее свойств .

2.3. Получение пористых кремнеземов с различным

средним диаметром частиц
2.4. Исследование кинетики иммобилизации ферментов на поверхности пористых неорганических носителей
при постоянной концентрации белка в растворе
2.5. Изучение кинетики иммобилизации белков при изменяющейся в ходе эксперимента концентрации последних
2.6. Определение скорости гидролиза мочевины растворимой и иммобилизованной уреазой .
2.7. Определение концентрации мочевины при помощи иммобилизованной на силохроме уреазы.
2.8. Исследование стабильности ферментного электрода.
Глава 3. зависимость процесса иммобилизации
Глава 4. Уреаза из i 1 .
4.1. Некоторые свойства нативного фермента
4.2. Иммобилизованная уреаза и ее свойства.
4.3. Использование иммобилизованной уреазы для опре
.деления концентрации мочевины .
Глава 5. Кинетика иммобилизации ферментов .
5.1. Исследование лимитирующей стадии процесса
. иммо билиз ации
5.2. Математическое описание кинетики иммобилизации ферментов на поверхности пористых неорганических матриц
5.3. Влияние среднего диаметра пор и удельной поверхности носителей на кинетику иммобилизации ферментов
Выводы
Литература


Для получения ковалентно иммобилизованных ферментов на поверхность носителя прививают группы, которые в мягких условиях в водном растворе, при комнатной температуре и 7 способны
реагировать с функциональными группами белковой глобулы. Разработано много способов активации поверхности органических и неорганических матриц , . Рассмотрим основные способы активации носителей, примененных в настоящей работе, кремнеземов. Как правило, на первой стадии поверхностные силанольные группы матрицы вводят в реакцию с У аминопропилтриэтоксисиланом. Модифицировать поверхность кремнезема ТГ аминопропилтриэтоксисиланом можно из паровой и жидкой фаз. В качестве растворителей применяют толуол, ацетон и воду . Аминоорганокремнезем используют в дальнейших синтезах, конечная цель которых получение привитых к поверхности матрицы групп, способных в мягких условиях реагировать с белками. Основные способы получения кремнеземов с наиболее перспективными для связывания ферментов активными группами описаны ниже. В работе было впервые предложено использовать привитые к поверхности пористого стекла соли диазония для ковалентного связывания ферментов. Синтезировали их путем обработки аминоорганокремнезема хлорангидридом пнитробензойной кислоты, последующим восстановлением нитрогрупп до аминогрупп и диазотированием последних
1аоОи к I . Активация кремнезема по представленной выше схеме,повидимому, происходит лишь в сильно кислой среде 1,0 в щелочной среде на этой стадии реакция не останавливается, а идет альдольная конденсация с образованием поверхностных олигомеров глутарового альдегида . В качестве бифункционального соединения, аналогичного глутаровому альдегиду, был предложен госсипол природное соединение, выделяемое из семян хлопчатника . Для прививки к поверхности хлорангидридных групп аминоорганокремнезем обрабатывают ангидридом дикарбоновой кислоты например, янтарным ангидридом. Все описанные выше активные группы синтезируются на основе аминоорганокремнеземов и могут в мягких условиях реагировать с аминогруппами ферментов, образуя ковалентную связь между белком и носителем , Существуют методы связывания ферментов и через карбоксильные группы, привитые к поверхности кремнеземов, например, иммобилизация с помощью водорастворимых карбодиимидов или реагента Вудворта . Карбоксильные группы на поверхности кремнеземов получают обработкой их аминопроизводных либо ангидридами дикарбоновых кислот , либо самими дикарбоновыми кислотами в присутствии карбодиимидов . Предложен также способ синтеза сульфгидрильных групп на поверхности кремнезема. ЩМНСОСНг 5 5 Епг
Отметим, что и в этом синтезе первой стадией является аминирование матрицы. Таким образом, большая часть способов активации поверхности кремнеземов требует предварительного введения аминогрупп. Использование иных производных относительно редко. В качестве примера приведем работу , в которой предложен способ получения ангидридных групп, присоединенных к поверхности силохрома. Он сводится к прививке винильных групп при помощи винилтрихлорсилана и последующей инициированной Тизлучением полимеризации мадеинового ангидрида на поверхности носителя. Отметим, что описанные выше группы могут быть привиты к поверхности кремнеземов минуя стадию аминирования матрицы. Так, взаимодействием меркаптоэтанола с кремнеземом получены привитые к поверхности сульфгидрильные группы , хлористого цианура хлорангидридные , гексаметилендиизоцианата изоцианатные . Однако, все эти методы имеют существенный недостаток прививка этих групп к поверхности осуществляется через гидролитически неустойчивую эхос связь. Этим авторы обзорной статьи объясняют тот факт, что полученные на оонове этих матриц препараты часто обладают относительно низкой стабильностью. Таким образом, в настоящее время достигнуты значительные успехи в разработке способов иммобилизации белков. Предложены различные по своей химической природе и свойствам поверхности матрицы, которые успешно использованы для получения иммобилизованных ферментов. Характер связи между матрицей и ферментами при ковалентной иммобилизации. Анализ литературы, посвященной водонерастворимым энзимам, свидетельствует о большом распространении метода ковалентной иммобилизации ферментов.