Новые аспекты применения нативной и иммобилизованной пероксидазы хрена для определения ее ингибиторов и субстратов

• Автор: Яблоцкий, Константин Витальевич
• Шифр специальности: 02.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 184 с. : ил.

1.1. Определение фторидионов

1.2. Определение цианидионов

1.3. Определение фосфатионов

1.4. Определение тиоцианаионов

1.5. Определение сульфидионов

1.6. Определение нитратионов

1.7. Определение сульфитионов

1.8. Определение сульфатионов

1.9. Определение оксалатиоиов

1 Определение формиагионов

1 Определение салицилагиоиов

Глава 2. Применение флуорнметрического метода дли определении
срсднсокисляемых субстратов пероксидами катехоламинов и их метаболитов
2.1. Определение катехоламинов и их метаболитов но их собственной флуоресценции
2.2. Определение катехоламинов и их метаболитов по флуоресценции их производных
2.3. Хемилюминесцентиое определение катехоламинов и их метаболитов
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 3. Исходные вещества, посуда, аппаратура, обработка результа
тов измерений, методика эксперимента
3.1. Исходные вещества
3.2. Посуда, аппаратура
3.3. Методики эксперимента
3.4. Обработка результатов измерений
Глава 4. Ковалентная иммобилизация перокендазы хрена на
модифицированных силикагелях средство повышения ее стабильности и чувствительности методик определения ингибиторов
4.1. Выбор носи теля для ковалентной иммобилизации пероксидазы
4.2. Оптимизация условий ковалентной иммобилизации пероксидазы на модифицированных силикагелях
4.3 Свойства препаратов пероксидазы, иммобилизованной на
модифицированных силикагелях
4.4. Оптимизация условий проведения индикаторной реакции окисления одианизидина пероксидом водорода для контроля активности и стабильности иммобилизованной пероксидазы
4.5. Кинетические параметры индикаторной реакции, проводимой с участием пероксидазы, иммобилизованной на модифицированных силикагелях
Глава 5. Влияние неорганических анионов на каталитическую
активность иммобилизованной пероксидазы
5.1. Влияние фторидионов на каталитическую активность иммобилизованной пероксидазы
5.2. Влияние цианидионов на каталитическую активность иммобилизованной i юроксидазы
5.3. Влияние тиоциапатионов на каталитическую активность нативной и иммобилизованной пероксидазы
5.4. Совместное влияние неорганических анионов на каталитическую активность иммобилизованной пероксидазы
5.4.1. Совместное влияние фторид и цианидионов на каталитическую активность иммобилизованной пероксидазы
5.4.2. Совместное влияние цианид и тиоциапатионов на каталитическую активность иммобилизованной пероксидазы
Глава 6. Определение неорганических анионов в водах и
биологических жидкостях с использованием иммобилизованной I пероксидазы
6.1. Определение фторидионов в питьевых и минеральных водах
6.2. Определение цианид и тиоцианатионов в крови
6.3. Определение тиоцианатионов в слюне
Глава 7. Применение нативной пероксидазы хрена для определения
катехоламинов и их мстабоблитов
7.1 Ферментативное окисление допамина и гомованилиновой кислоты 7 в водных и водноорганичсских средах
7.1.1. Определение допамина по его собственной флуоресценции 9 и по его пероксидазному окислению в присутствии ДМСО
7.1.2. Определение гомованилиновой кислоты по ее перокси 2 дазному окислению
7.2 Получение флуоресцирующих производных катехоламинов и их 5 метаболитов в присутствии пероксидазы
7.2.1. Выбор фермента для его применения в процессах
дериватизации катехоламинов
7.2.2. Оптимизация условий получения флуоресцирующих
производных катехоламинов и их метаболитов с
дифенилэ1 илепдиамином и бензиламином
7.2.3. Разработка ферментативных методик определения
катехоламинов и их метаболитов по их флуоресцирующим производным
7.3. Пути повышения чувствительности определения катехоламинов и
их метаболитов по их флуоресцирующим производным
ферментативным методом
7.3.1. Определение катехоламинов и их метаболитов в средах 4 прямых мицелл Г1АВ
7.3.2. Определение катехоламинов и их метаболитов с
использованием метода лазерной флуоримстрии
7.3.3. Определение гомованилиновой кислоты в моче по
флуоресценции ее производного
Глава 8. Определение пероксидов в водных, водноорганических и 5 мицеллярных средах с использованием нативной пероксидазы
8.1. Определение органических пероксидов и пероксида водорода в 7 водных и водноорганических средах по иероксидазному окислению
ими флуорссцсина
8.2. Влияние ПАВ на катализируемую пероксидазой реакцию
окисления флуоресцеина пероксидом водорода и органическими
пероксидами в водных и водноорганических средах
8.3 Определение щеибутилгидропсроксида в оливковом масле
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ВВЕДЕНИЕ


При этом количество образовавшегося этанола пропорционально концентрации фторидиоиов. Затем высвободившийся этанол смешивали с потоком раствора никотинамидадсниндинуклсотида НАД. Объединнный раствор пропускали через второй ферментный реактор, содержащий иммобилизованную па силикагеле алкогольдегидрогеназу, катализирующую взаимодействие этанола с окисленной формой НАД, в результате которого образуется ацетальдегид и ПАДИ. Концентрацию образовавшегося НАДИ определяли спектрофотометрически при 0 нм. Установлено, что фторидионы ингибируют активность эстсразы быстро в течение с и обратимо. Ферментные препараты, использованные в проточных реакторах, сохраняют каталитическую активность в течение двух месяцев. Относительное стандартное отклонение результатов определения концентраций в середине диапазона не превышает 0. В большинстве методик ферментативного определения анионов используют биосенсоры на основе иммобилизованных на полимерных носителях биокатализаторов, выделенных в чистом виде или содержащихся в тканях растений 7. В последнем случае часто отсутствует необходимость выделения фермента из ткани растений вследствие его высокой каталитической активности, тем более, если биокатализатор обладает индивидуальной субстратной специфичностью, как например, аскорбатоксидаза, содержащаяся в мякоти огурца. Так, для определения фторидионов предложен 7 амперомстрический биосенсор на основе пероксидазы аспарагуса. Ткань аспарагуса, содержащая фермент, была прикреплена непосредственно к поверхности угольного настового электрода, содержащей ферроцен в качестве электромедиатора. Определение фторидионов основано на их ингибирующем действии на активность пероксидазы, выразившемся в уменьшении тока окисления пероксида водорода. Измерения проводили в 0, М фосфатном буферном растворе 5,0 при потенциале мВ. Чувствительность ферментного электрода уменьшается на по сравнению с первоначальным значением по истечении дней в связи с понижением активности фермен та. Следует отметить, что такие биосеисоры имеют ряд преимуществ, связанных со значительным удешевлением анализа, простотой методики и конструкции сенсора, высокой чувствительностью и возможностью применения ферментов, которые в чистом виде еще нс выделены. Однако стабильность и селективность таких электродов ост авляют желать лучшего. Сконструирован амперометрический биосенсор 8 на основе угольного ластового электрода, который был применен в проточной системе для определения фторидионов по их ингибирующему действию на активность бутирилхолинэстеразы, выделенной из сыворотки крови лошади, и иммобилизованной на мембранах, изготовленных из различных материалов найлона, нитрата целлюлозы и белой писчей бумаги. В качестве индикаторной была использована реакция гидролиза бутирилтиохолина, в результате которой образуется масляная кислота и тиохолин, концентрации которого пропорционален максимальный ток его окисления, измеренный при потенциале 0 мВ. Наиболее широкий диапазон определяемых содержаний фгоридионов достигается в случае иммобилизации бутирилхолинэстеразы на нитрате целлюлозы. Влияние природы материала мембраны на чувствительность проточноинжекционной методики определения фторидионов авторы объясняют неравномерным распределением ингибитора в мембране. Другие метрологические характеристики этой методики представлены в табл. Анализ литературных данных о методиках ферментативного определения фторидионов показывает табл. Использование ферментов позволяет определять меньшие содержания этого аниона, чем возможно определять другими известными методами. Таблица 1. Таблица 2. Фермент Носитель Метод детектирования Диапазон определ. М . Активное использование цианидионов в промышленности для экстракции золота и серебра из руд и в сельском хозяйстве в качестве дезинфицирующего средства обусловило необходимость создания высокочувствительных методов определения этих анионов в объектах окружающей среды. Ферментативное определение цианидионов основано на их ингибирующем действии на каталитическую активность супероксиддисмутазы и пероксидазы хрена 3, 9.