Сравнение аналитических возможностей алкогольдегидрогеназ различного происхождения при определении их ингибиторов и кофактора

• Автор: Бычков, Павел Валерьевич
• Шифр специальности: 02.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 237 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ.

Обзор литературы.

Глава 1. Основные сведения об алкогольдегидрогеназе из печени лошади.

1.1. Структура алкогольдегидрогеназы из печени лошади.

1.2. Субстратная специфичность алкогольдегидрогеназы из печени лошади

1.3. Коферментная функция НАД НАДН

1.4. Механизм действия алкогольдегидрогеназы из печени лошади

Глава 2. Эффекторы алкогольдегидрогеназы из печени лошади.

2.1. Влияние на каталитическую активность алкогольдегидрогеназ ионов тяжелых металлов и органических реагентов, взаимодействующих с сульфгидрильными 8Н группами фермента.
2.2. Влияние неорганических анионов на каталитическую активность алкогольдегидрогеназы из печени лошади.
2.3. Влияние на каталитическую активность алкогольдегидрогеназ органических реагентов, образующих комплексные соединения с каталитическим цинком фермента.
2.4. Влияние жирных кислот и их амидов на каталитическую активность алкогольдегидрогеназы из печени лошади.
2.5. Влияние на каталитическую активность алкогольдегидрогеназ ацетилирующих реагентов
2.6. Влияние на каталитическую активность алкогольдегидрогеназ аналогов субстрата и кофермента
2.7. Влияние на каталитическую активность АДГ лекарственных препаратов.
Глава 3. Способы получения и реактивации различных апоферментов.
Экспериментальная часть.о
Глава 4. Исходные вещества, посуда, аппаратура, методика эксперимента, обработка результатов измерений.
4.1. Исходные вещества.
4.2. Посуда, аппаратура
4.3. Методика эксперимента.
4.4. Обработка результатов измерений.
Глава 5. Обоснование выбора фермента и индикаторной реакции
оптимизация условий ее проведения.
Глава 6. Влияние на каталитическую активность АДГ из печени лошади неорганических ингибиторов
6.1. Влияние ионов тяжелых металлов на каталитическую активность
АДГ из печени лошади.
6.2. Тип ингибирования алкогольдегидрогеназы из печени лошади ртутьюН
6.3. Определение ртутиЦ, серебраГ, цинкаП и олова1У по их ингибирующему действию на алкогольдегидрогеназу из печени лошади.
6.4. Влияние некоторых неорганических анионов на каталитическую
активность АДГ из печени лошади
Глава 7. Влияние на каталитическую активность АДГ из печени лошади органических производных ртути и олова
7.1. Влияние метилртути на катазитическую активность АДГ из печени лошади
7.1.1 Определение метилртути по ее ингибирующему действию на
алкогольдегидрогеназу из печени лошади.
7.1.2. Тип ингибирования алкогольдегидрогеназы метилртутыо.
7.2. Влияние на каталитическую активность АДГ из печени лошади мстил, диметил и триметилолова
7.2.1. Тип ингибирования алкогольдегидрогеназы метилоловом.
Глава 8. Влиянии на каталитическую активность АДГ различных
ОРГАНИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ
8.1. Влияние на каталитическую активность АДГ из печени лошади карбоновых кислот
8.1.1. Влияние на АДГ из печени лошади предельных неразветвленных одноосновных карбоновых кислот СэСб.
8.1.2. Возможные причины влияния жирных кислот на каталитическую активность алкогольдегидрогеназы из печени лошади.
8.1.3. Тип ингибирования алкогольдегидрогеназы из печени лошади
масляной кислотой
8.1.4. Влияние некоторых двухосновных карбоновых кислот на активность
АДГ из печени лошади.
8.1.5. Влияние некоторых жирных кислот на активность АДГ из пекарских дрожжей.
8.1.6. Определение янтарной кислоты в лекарственных растениях
8.2. Влияние на каталитическую активность АДГ из печени лошади ряда аминокислот.
8.2.1 Определение пролина, триптофана и гистидина по их ингибирующему действию на алкогольдегидрогеназу из печени лошади
8.2.2. Тип ингибирования алкогольдегидрогеназы триптофаном.
8.3. Влияние азотсодержащих органических соединений на каталитическую активность АДГ из печени лошади.
8.3.1 Определение азотсодержащих соединений по их ингибирующему действию на алкогольдегидрогеназу из печени лошади
8.3.2. Возможные причины влияния азотсодержащих органических соединений на каталитическую активность алког ольдегидрогеназы
Глава 9. Получение и реактивация апофермента АДГ из печени лошади.
9.1. Выбор лиганда и условий для получения апоалкогольдегидрогеназы из
печени лошади
9.2. Изучение влияния цинкаН на псевдоапоалкогольдегидрогеназу из печени лошади, полученную с использованием 1,фенантролина.
9.3. Влияние ионов металлов на исевдоапоалкогольдегидрогеназу из печени лошади, полученную в присутствии 1,фснантролина
9.4. Получение истинного апофермента алкогольдегидрогеназы и его реактивация ионами цинка и кобальта.
9.4.1 Получение апофермента алкогольдегидрогеназы с использованием
1,фенантролина
9.4.2. Получение апофермента алкогольдегидрогеназы с использованием 2,6дипиколиновой кислоты.
Заключение.
Выводы.
Приложение.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Ряд экспериментальных данных позволил авторам предположить, что два иона цинка в субъединице фермента действительно имеют различное окружение и, следовательно, играют различную роль каталитическую и структурную. Каталитический ион цинка выполняет функцию кислоты Лыоиса, облегчая процесс активации гидроксильной группы спирта в процессе окисления спиртов . ЦинкН входит в активный центр фермента в окружении одного гистидинового Н1 и двух цистеиновых Суэ и Суй4 остатков, а также молекулы воды в отсутствие субстрата, образуя при этом комплекс с искаженной тетраэдрической геометрией. Цистеиновыс остатки присутствуют в виде гиолатионов, т. Авторы приводят доказательства того, что связывание спирта со свободным ферментом, так же, как и с комплексом АДГАД, происходит в результате прямого взаимодействия с ионом цинка. Альдегиды к каталитическому цинку не присоединяются. Рис. Установлено , что структурная роль цинка состоит в поддержании целостности всей структуры нативной АДГ, а также в ее стабилизации при возникающих конформационных изменениях, происходящих в процессе связывания с ферментом субстрата и кофермента. Также было выяснено, что вторичные и четвертичные структуры апоАДГ и нативного фермента эквивалентны. Из полученных результатов авторы делают вывод о возможности выполнения этой функции гистидиновыми остатками. Эксперименты, проведенные авторами методом полярографии, показали, что структуры каталитического и структурного центров АДГ из печени лошади можно представить в виде металл1,2дитиоленового и метаялбис 1,2дитиоленового комплексов соответственно. При этом каталитический ион цинка рис. Структурный же ион цинка связан с четырьмя ионами серы цистеиновых остатков. Рис. Помимо двух ионов цинка на субъединицу АДГ приходится до свободных вН групп . Предположительно, сульфгидрильные 5Н группы участвуют, главным образом, в связывании АДГ с коферментом. Определяющую роль сульфгидрильных групп в проявлении каталитической активности АДГ была показана в работе . Авторы модифицировали 8Нгруппы фермента при помощи К, йодоацетата и йодацетамида, что неизбежно приводило к полной потере ферментативной активности биокатализатора. При этом отмечается, что НАД и НАДН обладают защитным действием, предотвращая карбоксиметилирование сульфгидрильных трупп белка . Последнее обстоятельство демонстрирует связывание различных форм кофермента посредством сульфгидрильных групп АДГ. В работе показано, что в обеспечении активности алкогольдегидрогеназы из печени лошади важную роль играют гистидиновые остатки аминокислот. Так, из семи гистидиновых остатков, приходящихся на субъединицу фермента, вносит наибольший вклад в активность АДГ, поскольку является основным звеном системы переноса протона от субстрата к коферменту. АДГ обладает весьма широкой субстратной специфичностью. Фермент катализирует превращение большого количества первичных и вторичных, а также ароматических, циклических и алифагических спиртов табл. Однако третичные спирты такие, как гретбутанол и третпентапол, изопропанол и полициклические спирты субстратами этого фермента не являются. АДГ катализирует окисление не только перечисленных соединений, но и витамина А, ннитробсизилового спирта, этиленгликоля . Алифатические и ароматические альдегиды, ароматические кетоны восстанавливаются в присутствии АДГ крайне медленно табл. АДГ из печени лошади не является специфичным ферментом по отношению к таким оптически активным субстратам, как бутан2ол, октан2ол и гексанЗол . Для объяснения подобного явления авторы провели ряд экспериментов по исследованию кинетики окисления НАД ь и изо. Показано, что константа Михаэлиса в реакции окисления спиртов уменьшается с увеличением длины алкильной цепи в их ряду, т. АДГПАД к алкильной группе возрастает с увеличением размера последней. Рис. Взаимодействие и нал кил карбинолов с гидрофобным центром. Таблица 2 . Значения относительной скорости катализируемой АДГ реакции окисления спиртов НАД
И
СПИРТ Глицин КаОН буферный раствор 9. М 0. Этанол 5 9. Пропанол 6 3. Бутанол 5 . Пснтанол 3. Гсканол 0 2. Г ептанол 2. Октанол 5 2. Бутанол 3. Циклогексанол 5 . Метилциклогексанол 1. ЗМетилциклогексанол 2. Метилциклогексанол . Бутилциклогексанол 4. Циклогептанол 6.