Определение аминокислот и их оптических изомеров методом двумерной ВЭЖХ

• Автор: Натыкан, Алексей Андреевич
• Шифр специальности: 02.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 143 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

МЕТОДЫ ЭНАНТИОМЕРННОГО АНАЛИЗА АМИНОКИСЛОТ

ГАЗОХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Хиральные реагенты в ГХ

Использование хиральных неподвижных фаз ХНФ

МЕТОДЫ ВЭЖХ

1 Хиральные реагенты для ВЭЖХ.

Хиральные неподвижные фазы.

ФазыПиркла.
Циклодекстрины.
ХНФ с краунэфирами
Лигандообменные ХНФ
Хиральные неподвижные фазы с привитыми полисахаридами
i Хиральные неподвижные фазы с иммобилизованными белками
Хиральные неподвижные фазы иммобилизованными макроциклическими
гликопептидными антибиотиками
Хиральные модификаторы подвижной фазы
Системы с переключением колонок
КАПИЛЛЯРНЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ
СПОСОБЫ АМИНОКИСЛОТНОГО ГИДРОЛИЗА.
Классические способы гидролиза белков.
лг Кислотный гидролиз соляной кислотой
Кислотный гидролиз с помощью сульфоновых кислот и других агентов.
Щелочной гидролиз
Ферментативный гидролиз
, Использование аналитических автоклавов для гидролиза белков.
Гидролиз под действием микроволнового излучения
Рацемизация аминокислот при гидролизе
3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
ИСХОДНЫЕ ВЕЩЕСТВА, АППАРАТУРА, МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА
Исходные реактитвы и растворы
Получение производных аминокислот с офталевым альдегидом
Аппаратура, сорбенты и подвижные фазы
Методика хроматографического эксперимента
Методика автоклавного разложения.
Методика пробоподготовки мясных продуктов
Методика пробоподготовки биологических жидкостей.
ОПТИМИЗАЦИЯ РАЗДЕЛЕНИЯ ОФА ПРОИЗВОДНЫХ АМИНОКИСЛОТ В
ОБРАЩЕННОФАЗОВОЙ ВЭЖХ.
Разделение офталевых производных аминокислот на неподвижной фазе
i С.
Разделение офталевых производных аминокислот на неподвижной фазе
x i ААЛ.
Оптимизация разделения офталевых производных аминокислот на
неподвижной фазе x i ААА
Построение модели удерэсиваниесвойство для офталевых производных
аминокислот
Определение аминокислот в лекарственных препаратах методом реакционной ВЭЖХ.
Определение качества мясной продукции
АВТОКЛАВНЫЙ ГИДРОЛИЗ ДЕТСКОГО ПИТАНИЯ
ИЗУЧЕНИЕ ХРОМАТОРАФИЧЕСКИХ СВОЙСТВ КОЛОНКИ ЫАЦПШЯЕ
Разделение аминокислот в нативной форме
Определение качества лекарственных препаратов Элтацин и Аспаркам.
Разделение аминокислот на колонке ИаиШюЕ в виде производных
ПРИМЕНЕНИЕ ДВУМЕРНОЙ ВЭЖХ ДЛЯ СТЕРЕСЕЛЕКТИВНОГО
ОПРЕДЕЛЕНИЯ АМИНОКИСЛОТ.
Определение энантиомеров аргинина в субстанции цефепим
Разделение ОФЛпроизводиых аминокислот на колонке ИаиШивЕ
Изучение производных аминокислот с ОФАМПК.
Изучение производных аминокислот с ОФАУМЭТ.
Изучение производных аминокислот с ОФАКПТ.
4. ВЫВОДЫ.
5. ЛИТЕРАТУРА.
ВВЕДЕНИЕ


На первой стадии дериватизации аминокислоты обрабатывали соляной кислотой в метаноле для получения метиловых эфиров. Далее проводили реакцию с МТФАС1 для получения диастереомерных амидов. Полученные производные вводили в газовый хроматограф с массспектрометрическим детектором. Этот метод успешно применяли для фармакокинетических исследований энантиомеров лейцина без мешающего влияния лейцина природного происхождения. Хиральные неподвижные фазы так же используются для стереоселективного определения аминокислот в биологических образцах. Наиболее часто применяют СЫгазПЬУа1, в этом сорбенте остатки Ьвалина ковалентно связаны с кварцевым стеклом. Эта неподвижная фаза позволяет разделить энантиомеры большинства аминокислот, входящих в состав белков, в виде их И,0пентафторпропионил изопропиловых эфиров . Этим методом Хашимото с сотрудниками 6 впервые обнаружили значительное содержание свободного Бсерина в мозговой ткани млекопитающих. Концентрация Бсерина составила 0 нмольг, от содержания всего свободного серина. Используя сорбент СЫгазПЬУа1, Брукнер с сотрудниками определили энантиомеры аминокислот в образцах человеческой мочи и плазмы крови и продемонстрировали, что в таких образцах наибольшие концентрации Баланина и Бсерина 7. В общем случае ВЭЖХ методы разделения энантиомеров можно разделить на две группы прямые и непрямые. Непрямой метод основан на ковалентном связывании молекул энантиомеров с другой хиральной молекулой, что приводит к образованию пары диастеререомеров. Разделение полученных диастереомеров может быть произведено на нехиральных колонках. Прямой метод основан на формировании нековалентной диастереомерной пары между молекулами энантиомеров и хиральным селектором. Хиральный селектор может быть иммобилизован на поверхности сорбента с образованием хиральной неподвижной фазы ХНФ или использоваться как хиральная добавка ХД в подвижную фазу. Каждый подход имеет свои плюсы и минусы табл. Таблица 1. Низкая стоимость нехиральных неподвижных фаз Рацематы можно разделить без введения дополнительных функциональных групп. Дериватизация может быть долгой и трудоемкой Высокая стоимость сорбентов . Многие биохимически важные соединения, такие как аминокислоты, биогенные амины и действующие вещества в лекарствах имеют в своем составе, по крайней мере, одну функциональную аминогруппу. Неудивительно, что реакции дериватизации по первичной вторичной аминогруппам широко изучены. Основными путями модификации аминогруппы, в том числе и в аминокислотах, являются образование амидов, карбаматов, уреаз и тиоуреаз. Реакции с хлорангидридами и хлорформиатами проходят быстро, с образованием соответствующих амидов и карбаматов. Другой способ дериватизации реакция с Исукцинимидиловыми эфирами. Хиральные изоцианаты и изотиоцианаты хорошие реактивы для получения устойчивых уреаз и тиоуреаз. Галогенам гидриды также хороши для дериватизации, так как реакции протекают в мягких условиях, однако их применение ограниченно безводными системами. В таблице 2 представлены популярные реагенты для получения диастереомерных производных с аминокислотами. Таблица 2. Ьаланин амид ФДАА, реагент Марфи это очень мощный инструмент для определения Оаминокислот и их аналогов . В работе показано определение Оаминокислот в биологических образцах с использованием ФДАА. Экстракты биологической ткани были обработаны этим реагентом, далее каждая аминокислота была выделена методом двумерной тонкослойной хроматографии, с последующим разделением энантиомеров методом ОФВЭЖХ. Этим методом были найдены Эсерин, Эаланин и Эпролин в человеческой плазме крови и в тканях почек крыс , . Другой хиральный дериватизирующий реагент, образующий флуоресцентные производные это флуоренилэтилхлорформиат ФЛЕК, его используют для разделения оптически активных аминов. Диастереомерные производные аминокислот с этим реагентом можно получить за несколько минут при комнатной температуре и без рацемизации. ФЛЕК позволяет разделить энантиомеры первичных аминокислот за один ввод в хроматограф . В работе Окума и Обе ФЛЕКпроизводные аминокислоты определяли методом обращенофазовой ионпарной хроматографии.