Влияние организованных сред на флуориметрическое определение гистамина и серотонина

• Автор: Ларионова, Дарья Анатольевна
• Шифр специальности: 02.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Саратов
• Количество страниц: 236 с. : ил.

Содержание

Список условных обозначений и сокращений

Введение

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Свойства и роль гистамина и серотонина в биологических объектах

1.1.1. Физикохимические свойства и способы получения гистамина и серотонина

1.1.2. Гистамин и серотонин в живых организмах

1.1.3. Г истамин как индикатор качества продуктов питания

1.1.4. Сопутствующие аминокислоты и биогенные амины

1.2. Методы определения гистамина и серотонина

1.2.1. Биологические и биохимические методы

1.2.2. Химические методы
1.2.3. Прочие методы
Глава 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. Реактивы
2.2. Аппаратура и техника измерений
2.3. Методики измерений и расчетов
2.3.1. Расчт предела обнаружения аминов
2.3.2. Методика хроматографирования
2.3.3. Проведение измерений поляризации флуоресценции
2.3.4. Расчет аналитических характеристик метода ПФИА Глава 3. ФЛУОРИМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГИСТАМИНА
3.1. Флуоримстричсскос определение гистамина с ОФА
3.1.1. Условия взаимодействия гистамина с ОФА, влияние ПАВ
3.1.2. Условия проведения реакции аминов с ОФА в присутствии различных нуклеофильных агентов, влияние ПАВ
3.2 Флуориметрическое определение гистамина с флуорескамином
3.2.1. Выбор оптимальных условий проведения реакции
3.2.2. Влияние ПАВ
3.2.3. Влияние ЦЦ
3.2.4. Градуировочные графики
Глава 4. ФЛУОРИМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СЕРОТОНИНА
4.1. Флуориметрическое определение серотонина по собственной
флуоресценции
4.1.1. Выбор оптимальных условий определения серотонина по собственной
флуоресценции
4.1.2. Влияние ПАВ
4.1.3. Градуировочные графики
4.2. Флуориметрическое определение серотонина с ОФА
4.2.1. Выбор оптимальных условий взаимодействия серотонина с ОФА
4.2.2. Влияние ПАВ
4.2.3. Градуировочные графики
4.3. Флуориметрическое определение серотонина с флуорескамином
4.3.1. Выбор оптимальных условий взаимодействия серотонина с
флуорескамином
4.3.2. Влияние организованных сред
4.3.3. Градуировочные графики
Глава 5. РАЗРАБОТКА МЕТОДИК ОПРЕДЕЛЕНИЯ АМИНОВ МЕТОДОМ ПФИА
5.1. Получение иммунореагентов и оптимизация условий определения аминов методом ПФИА
5.1.1. Синтез конъюгатов гистамина и серотонина с белками
5.1.2. Синтез флуоресцеинмеченных антигенов трейсеров
5.2. Разработка метода ПФИА для определения гистамина
5.2.1. Иммунореагенты для определения гистамина
5.2.2. Титрование антител определение степени связывания антител антигеном
5.2.3. Градуировочные графики
5.3. Разработка метода ПФИА для определения серотонина
5.3.1. Иммунореагенты для определения серотонина
5.3.2. Титрование антител определение степени связывания антител антигеном
5.3.3. Градуировочный график
5.4. Разработка метода ПФИА для определения эфедрина
5.4.1. Синтез иммунореагентов
5.4.2. Определение степени связывания титрование антител
5.4.3. Градуировочный график
5.5. Разработка метода ПФИА для определения имазалила
5.5.1. Определение степени связывания антител кривые титрования
5.5.2. Градуировочный график
Глава 6. ПРОБОПОДГОТОВКА БИООБЪЕКТОВ И МЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГИСТАМИНА И СЕРОТОНИНА
6.1. Разделение и количественное определение гистамина и серотонина методом тонкослойной хроматографии
6.1.1. Выбор оптимальных условий хроматографирования
6.2. Практическое использование организованных сред для определения гистамина и серотонина
6.2.1. Флуориметрическое определение гистамина в пищевых продуктах
6.2.2. Флуориметрическое определение гистамина и серотонина в моче 8 ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


При проведении микробиологических исследований разных тканей мороженого полосатого тунца гистаминпродуцирующие бактерии были обнаружены только в жабрах и относились к энтеробактериям ii, i ii . Энтеропатогенные культуры . В Японии, при расследовании случая отравления гистамином, содержащимся в рыбе, был обнаружен новый штамм бактерий, способных продуцировать гистамин в больших количествах. Этот штамм идентифицировали как i . Существуют различные способы обработки пищевого сырья, приводящие к уменьшению содержания аминов, в том числе и гистамина. Удлинить срок хранения рыбы можно с помощью вакуумной упаковки и модифицированной атмосферы , . Некоторые пряности, прежде всего корица и гвоздика, очень эффективны против роста бактерий и образования биогенных аминов . В биологических образцах встречаются и другие аминосодержащие соединения. С одной стороны, они часто мешают определению гистамина и серотонина, с другой не только оказывают влияние на организм человека, но и усиливают действие гистамина и серотонина, поэтому при их присутствии существует необходимость раздельного определения аминов. I, табл. Биологические и биохимические методы Биологические методы Биологические методы анализа основаны на влиянии аминов на уровень кровяного давления кошек и собак, сократительную способность гладкой мускулатуры отрезка кишки или матки, сосудов перфузированного уха кролика и свиньи, способность вызывать бронхоспазм у морских свинок 3, . Биологические методы достаточно чувствительны, в некоторых случаях селективны. Применение этих методов связано с использованием большого количества биологического материала, высокой погрешностью определения, вследствие зависимости от различных биологических условий. В связи с этим, в последнее время биологические методы для определения гистамина и серотонина практически не используются. Радиоэнзимный метод Радиоэнзимный метод обладает высокой чувствительностью и специфичностью, однако для определения гистамина , и серотонина , используется сравнительно редко. Это связано со сложностью предварительных химических операций, трудоемкостью, высокой стоимостью ферментов . Кроме того, на воспроизводимость и чувствительность определения влияет источник получения фермента , а при анализе крови на воспроизводимость определения большое влияние оказывает антикоагулянт . Иммунохимические методы Иммунохимические методы очень удобны для рутинного анализа вследствие своей простоты, быстроты и возможности анализа большого числа образцов. Главное требование наличие специфичных к определяемому амину антител . Поскольку гистамин и серотонин имеют небольшую молекулярную массу и, как правило, не являются иммуногенами, для получения антител их конъюгируют с высокомолекулярными молекулами, обычно протеинами , . Существует два подхода к получению конъюгатов. Первый основан на взаимодействии аминогруппы амина с реагентом, связывающим его с белком . При получении конъюгата вторым способом амин непосредственно связывается с белком через атом азота, находящийся в кольце . В этом случае мешающее влияние оказывают структурно похожие компоненты. Следует отметить, что при некоторых заболеваниях в организме человека могут вырабатываться аутоантитела на амины. Так, аллергические заболевания различного типа сопровождаются выработкой аутоантител на гистамин , для больных наркоманией или при различных психических расстройствах характерно повышенное содержание антител на серотонин , . Самым распространенным иммунохимическим методом определения аминов является твердофазный гетерогенный иммуноферментный анализ I i i , . Метод основан на конкурентном связывании исходного амина и амина меченого пероксидазой с ограниченным количеством моноклональных антител. В качестве мостика для образования конъюгата аминбелок используют рбензохинон или эфиры пропионовой кислоты . Антитела, полученные на такой конъюгат, не реагируют с исходным веществом, поэтому перед анализом необходима химическая дериватизация амина. Эта стадия требует дополнительного времени, а в случае бензохинона связана с применением токсичных реагентов . С недавнего времени в некоторых тестнаборах стали применять поликлональные антитела, распознающие амин без дериватизации .