Новые варианты иммунохимического анализа с вольтамперометрическим контролем

• Автор: Кутырева, Марианна Петровна
• Шифр специальности: 02.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Казань
• Количество страниц: 163 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ИММУНОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА

1.1. Использование иммунохимических реакций для

определения физиологически активных соединений

1.1.1. Иммуноферментные методы в развитии вариантов

иммунохимического анализа

1.1.2. Применение принципов иммунохимического анализа в мониторинге окружающей среды на содержание
пестицидов

1.1.3. Иммунохимические методы определения гербицидов

сим 1,3,5 триазинового ряда
1.2. Иммуносенсоры как детекторы в иммунохимическом
анализе
2. КИНЕТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ
2.1. Влияние эффекторов на каталитическую активность
ферментов
2.2. Кинетические параметры ферментативной реакции в
присутствии и отсутствие эффекторов
3. ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ, АППАРАТУРА, ОБЪЕКТЫ
ИССЛЕДОВАНИЯ И УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
3.1. Постановка задачи
3.2. Объекты исследования и приготовление растворов
3.3. Приборы и техника измерений
3.3.1. Устройство амперометрического иммуноферментного
сенсора
3.3.1.1 Иммобилизация антител
3.4. Аналитический сигнал
3.5. Обработка экспериментальных данных
4. КИНЕТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
ФЕРМЕНТАТИВНОЙ И ИММУНОХИМИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ ВЫБОРА РАБОЧИХ УСЛОВИЙ ПРОВЕДЕНИЯ
ИММУНОХИМИЧЕСКИХ ОПРЕДЕЛЕНИЙ
4.1. Кинетические параметры реакции холинэстеразного
гидролиза в присутствии в качестве эффекторов компонентов иммунохимического взаимодействия
4.1.1. Влияние компонентов иммунохимического
взаимодействия на каталитическую активность иммобилизованной холинэстеразы
4.1.1.1 .Действие иммунного комплекса антигенантитело на каталитическую активность иммобилизованной холинэстеразы
4.1.1.2.Влиянис гербицидов сим 1.3,5 триазинового ряда на каталитическую активность иммобилизованной холинэстеразы
4.1.2. Кинетические параметры реакции гидролиза БТХИ
кажущаяся константа Михаэлиса и максимальная скорость реакции в присутствии ИХЭ и иммунного комплекса антигенантитело
4.1.3. Кинетические параметры реакции холинэстеразного гидролиза БТХИ в присутствии представителей
гербицидов 1руппы сим 1,3,5 триазинового ряда
4.2. Влияние на величину кинетических параметров реакции
гидролиза БТХИ в присутствии ИХЭ и иммунных комплексов антигенантитело или гербицидов
4.3. Константы связывания иммунохимических взаимодействий
4.3.1. Определение констант связывания иммунного комплекса i iАт и iАт по
данным вольтамперометрии
4.3.2. Константы связывания иммунного комплекса
антитело гербицид
4.4. Рабочие условия иммуноферментного определения антигенов i i и i и гербицидов симазина, атразина и пропазина на основе кинетических характеристик ферментативной и иммунологических реакций
5. ВАРИАНТЫ ИММУНОХИМИЧЕСКИХ ОПРЕДЕЛЕНИЙ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ С ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИЧЕСКИМ КОНТРОЛЕМ
5.1. Иммуноопределение антигенов i i и
i с помощью амперометрического иммуноферментного сенсора
5.2 Иммуноопределение некоторых гербицидов хруппы сим 1.3,5 триазинового ряда с использованием амперометрического холинэстеразного биосенсора
5.3. Оценка специфичности иммунохимических определений антигенов и гербицидов
5.4. Определение некоторых антигенов и гербицидов в обьектах с использованием разработанного варианта иммуноферментного анализа с вольтамперометрическим контролем
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА


В пятой главе предложены варианты иммуноферментных определений антигенов i i и i с помощью иммуноферментных сенсоров и иммунохимических определений гербицидов триазинового ряда симазина и атразина с использованием иммуноферментных систем. Обсуждены вопросы специфичности этих определений. Представлены методики определения патогенных грибов и триазиновых гербицидов в модельных смесях и объектах окружающей среды. Теоретические основы иммунохимического анализа ИХА опираются на современную иммунохимию, знание физико химических закономерностей реакции антигенантитело, а так же основные принципы аналитической химии. Сущность иммунохимических методов составляет реакция взаимодействия антител Ат с антигенами Аг, протекающая в несколько стадий, первой из которых является обратимое образование иммунного комплекса ИК состава 1
Аг Ат АгАт 1. АгАт 1,2. Антитела специфические белки крови иммуноглобулины, вырабатываемые организмом в ответ на введение чужеродных веществ с характерными химическими группировкам , называемых антигенами. К Аг относятся белки, полисахариды, липосахариды, нуклеиновые кислоты, как в очищенном виде, так и в виде компонентов различных биологических структур клеток, тканей, вирусов и т. Низкомолекулярные вещества молекулярная масса менее не обладают антигенными свойствами, то есть при попадании в организм не вызывают иммунного ответа и образования Ат. Для того, чтобы стимулировать иммунный ответ, такие вещества должны быть ковалентно соединены с крупными молекулами обычно белками полученные коньюгаты и используются для иммунизации животных. В качестве носителя чаще всего используют бычий сывороточный альбумин, овал ьбу мин, тироглобулин. Выделяемая после иммунизации антисыворотка содержит смесь Ат, часть которых может оказаться способной узнавать гаптен в свободном состоянии. К гаптенам относится широкий круг природных соединений пептидные и стероидные гормоны, различные лекарственные препараты антибиотики, барбитураты, сердечно сосудиегые препараты, атиэпилептики и наркотические вещества, а так же олигосахариды, олигонуклеотиды и пестициды. Биологическая функция Ат заключается в защите организма от чужеродных веществ, путем образования прочных специфических ИК с соответствующими антигенами и последующего удаления их из организма. Способность Ат образовывать высокоспецифичные ИК с различными веществами по системе ключ замок и возможность получения Ат в необходимых количествах иммунизация животных являются основой ИХА. Ат в присутствии Аг преципитата осадка с визуальной регистрацией произошедшего взаимодействия . Однако, для визуальной регистрации процесса преципитации небходимы высокие концентрации компонентов и длительное время проведения реакции. Современные методы ИХА условно делятся на две группы неиспользующие меченных реагентов и требующие меченных Ат или Аг. При использовании методов второй группы индикация образовавшегося комплекса АгАт осуществляется введением в один из исходных компонентов реакционной системы метки, которая легко детектируется соответствующим физико химическим методом. Весьма удобными для этих целей оказались изотопные, флуоресцентные, ферментные и парамагнитные метки, использование которых дало возможность увеличить чувствительность методов ИХА в миллионы раз, а время анализа уменьшить до нескольких часов. В зависимости от вида метки различают радиоиммунный, иммунофлуоресцентный, иммуноферментный, иммунохемилюминесцентный и другие методы иммуноанализа . Существуют гетерогенные методы ИХА, если один из компонентов иммунохимической системы химически ковалентно или сорбционно соединяют с твердофазным носителем, чтобы отделить специфический ИК от компонентов реакционной смеси, и гомогенные методы, если нет необходимости проводить разделение компонентов ИХА. Для достижения высокой специфичности, чувствительности, воспроизводимости, экспрессности и автоматизации ИХА принципиально возможным является использование только первой стадии иммунохимических взаимодействия. Так как процесс образования иммунного комплекса Аг определяемое вещество Ат происходит в строго количественном соотношении, то экспериментально устанавливаемая концентрация метки, входящей в сотав образующегося И К, однозначно связана с исходной концентрацией Аг.