Ферментативное определение цинка и магния на основе их действия на щелочные фосфатазы различного происхождения

• Автор: Жаворонкова, Анна Михайловна
• Шифр специальности: 02.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 211 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Источники, структура, физикохимические характеристики и

механизм действия щелочных фосфатаз бактериального и животного происхождения

1.1. Источники щелочных фосфатаз.

1.2. Структура и аминокислотный состав щелочных фосфатаз II

1.3. Роль ионов металлов в структуре и каталитической активности щелочных фосфатаз.

1.4. Механизм действия щелочных фосфатаз

1.5. Субстратная специфичность щелочных фосфатаз

Глава 2. Влияние ионов металлов на каталитическую активность

щелочных фосфатаз различного происхождения и их

апоферментов.
2.1. Влияние ионов металлов на активность бактериальных и
животных щелочных фосфатаз.
2.2. Влияние ионов металлов на апоферменты бактериальных и
животных щелочных фосфатаз.
Глава 3. Роль цинка и магния в биологических объектах и методы их
определения
3.1. Значение цинка для организма человека, контроль его содержаний.
3.1.1. Биологическая роль цинка.
3.1.2. Методы определения цинка II в биологических жидкостях
3.2. Значение магния для организма человека, контроль его
содержаний.
3.2.1. Биологическая роль магния
3.2.2. Методы определения магния II в биологических жидкостях
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 4. Исходные вещества, посуда, аппаратура, методика 4 эксперимента, обработка результатов измерений
Ф 4.1. Исходные вещества
4.2. Посуда и аппаратура.
4.3. Методика эксперимента.
4.4. Обработка результатов измерений
Глава 5. Выбор фермента, индикаторной реакции и оптимальных
условий ее проведения
5.1. Выбор фермента.
5.2. Выбор индикаторной системы.
5.3. Выяснение оптимальных условий проведения индикаторной
реакции
Глава 6. Влияние ионов металлов на каталитическую активность
щелочных фосфатаз, выделенных из различных источников .
6.1. Влияние ионов цинка на каталитическую активность
щелочных фосфатаз, выделенных из трех различных источников.
6.1.1. Выяснение типа ингибирования щелочных фосфатаз нонами
6.1.2. Влияние ионов металлов на каталитическую активность
щелочных фосфатаз различного происхождения
6.2. Влияние ионов цинка на каталитическую активность
щелочной фосфатазы из кишки тюленя в различных буферных растворах
6.3. Влияние ионов магния на каталитическую активность трех
щелочных фосфатаз.
6.4. Совместное влияние ионов металлов на каталитическую
активность щелочной фосфатазы из кишки тюленя в различных буферных растворах
Глава 7. Выбор оптимальных условий получения апоферментов
щелочных фосфатаз.
7.1. Влияние ЭДТЛ на каталитическую активность щелочных
фосфатаз
7.2. Влияние органических соединений различных классов на
каталитическую активность щелочной фосфатазы из кишки тюленя
7.3. Получение истинного апофермента щелочной фосфатазы из
кишки тюленя с использованием диализа
7.3.1. Выбор оптимальн,ix условий получения апофермента щелочной фосфатазы из кишки тюленя
Глава 8. Реактивирование апоферментов щелочных фосфатаз из
кишечника цыпленка и кишки тюленя ионами металлов
8.1. Реактивирование апоферментов, полученных с
использованием ЭДТА.
8.1.1. Изучение влияния на апоферменти ионов цинка и ряда других металлов
8.1.2. Изучение влияния ионов магния и кальция на апофосфатазу
из кишки тюленя
8.1.3. Реактивирование апофосфатазы из кишки тюленя, полученной диализом.
8.2. Реактивирование апоферментов, полученных с
использованием нитрилотриметиленфосфоновой кислоты .
Глава 9. Разработка методики определения цинка II но его реактивирующему действию на апофосфатазу из кишки
тюленя
Глава . Ферментативные методики определения цинка И и магния
II в биологических объектах
.1. Определение цинка II в сыворотке крови по реактивированию апофермента щелочной фосфатазы из кишки тюленя
.2. Определение магния II в моче по его активирующему действию на каталитическую активность щелочной фосфатазы из кишечника цыпленка.
.2.1. Подготовка проб мочи к анализу
.2.2. Методика определения магния в моче.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Микробные щелочные фосфатазы способны образовывать новые активные гибриды из мономеров двух ферментов, выделенных из разных микроорганизмов. Это указывает на близость вторичных структур таких фосфатаз, несмотря на различия в составе и иммунологических свойствах их субъединиц. Так, например, С. Лсвинтапь с сотр. В настоящее время наиболее изучена щелочная фосфатаза из . Методом рентгеноструктурного анализа установлена пространственная структура этого фермента . Он представляет собой каталитически активный симметричный димер с молекулярной массой ж кДа рис. Дж. Рейнольдс и М. Шлезингер в гг. Н0
Рис. Схема активного центра димерной молекулы щелочной фосфатази из . Да при 8. Авторы 6 предположили, что молекулярная масса фермс1гга возрастает вследствие быстрой и обратимой самоассоциацни димеров с образованием тетрамера. Таким образом, при 8. Согласно данным работы , процесс образования тетрамера сопровождается конформационными изменениями внутри димера каждая субъединица в тетрамере связывает два дополнительных введенных извне нона цинка. Кроме того, в работе была высказана гипотеза об отсутствии активности у мономера и тетрамера. В г. Е.С. Чухрай и др. Важно отметить, что равновесия 1 и 2 имеют разное значение для стабильности и активности фермента. Равновесие мономер димер 1 в обычных условиях полностью сдвинуто в сторону образования каталитически активного димера и фиксируется структурой конформационного замка . Распад димера на мономеры сопровождается инактивацией фермента. Обратимую диссоциацию димерной щелочной фосфатазы на неактивные мономеры согласно , можно осуществить несколькими способами 1 обработкой фермента 8 М раствором мочевины 2 понижением до 4 и ниже 3 удалением цинка хслатирующимн агентами 4 повышением температуры. Равновесие димер тетрамер 2 значительно более подвижно, поэтому именно оно может играть важную роль в регуляции каталитической активности фермента и выполнении его биологических функций. В работе показано, что активными могут быть не только димеры щелочной фосфатазы из . Активные ассоциаты щелочной фосфатазы из . Согласно данным рентгеноструктуриого анализа , нсдиссоциированный димер не имеет на своей поверхности протяженных гидрофобных участков положительно и отрицательно заряженные группы аминокислотных остатков распределены по поверхности белка более или менее равномерно. Следовательно, когтактными участками молекул димера при формировании тетрамеров могут быть гстсрополярные участки поверхности белка, связанные с соответствующими полипептиднымн образованиями в активных центрах димера. Таким образом, смещение равновесия между различными формами щелочной фосфатазы позволяет исследователю подобрать такие условия, при которых будет преобладать только одна из молекулярных форм фермента. Аминокислотный состав всех щелочных фосфатаз независимо от источника выделения бактерии или животное практически одинаков. Интересно отмстить, что щелочные фосфатазы человека и животных подобны но своему аминокислотному составу бактериальным например, заметные сходства обнаружены у щелочных фосфатаз. Е.соН . Цепочная фосфатаза животного происхождения, являясь гликопротенном, имеет набор органоспецифических форм, различающихся между собой углеводной частью. Па основании данных о взаимодействии фермента с пектинами, для которых хорошо известна их олигосахаридная специфичность, были установлены углеводные структуры щелочной фосфатазы из слизистой тонкой кишки тюленя . Сравнение аминокислотного состава щелочных фосфатаз из тонкой кишки тюленя и печени быка выявило лишь одно отличие более низкое содержание в тюленьей фосфатазе остатков тирозина и аланина при одновременном, хотя и незначительном, обогащении сернном, изолейцином, лейцином, фенилаланином, гистидином и лизином . Аналогичны не только состав, но и последовательность аминокислот в щелочных фосфатазах различного происхождения. Высокая идентичность аминокислотной последовательности установлена в области активных петров щелочных фосфатаз из большого числа бактерий, животных и человека , , , .