Пероксидазные и холинэстеразные сенсоры на основе модифицированных графитовых электродов

• Автор: Супрун, Елена Владимировна
• Шифр специальности: 02.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Казань
• Количество страниц: 170 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ФЕРМЕНТНЫЕ СЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ И ПЕРОКСИДАЗЫ Литературный обзор.

1.1. Методы иммобилизации холинэстеразы и пероксидазы для создания электрохимических ферментных сенсоров.

1.1.1. Способы иммобилизации холинэстеразы.

1.1.2. Иммобилизация пероксидазы

1.2. Пероксидазные электрохимические сенсоры

1.2.1. Прямой перенос электрона с участием пероксидазы.

1.2.2.Использование медиаторов электронного переноса.

1.3. Аналитическое применение пероксидазных сенсоров

1.3.1. Определение субстратов перокендаз.
1.3.2. Определение эффекторов перокендаз.
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
2.1. Материалы и реагенты.
2.2. Приборы и оборудование.
2.3. Изготовление ферментных сенсоров .
2.3.1. Ферментные сенсоры на базе печатных электродов, изготовленных в университете г. Перпиньян Франция
2.3.2. Ферментные сенсоры на основе планарных графитовых электродов
производства НЛВП ИВА
2.3.3. Модификация печатных электродов, изготовленных в университете Тог Уегдаш, г. Рим.
2.3.4. Изготовление пероксидазных сенсоров на основе печатных электродов, изготовленных в университете г. Нант
2.4. Определение пестицидов.
3. ОПЕРАЦИОННЫЕ ПАРАМЕТРЫ ХОЛИНЭСТЕРАЗНЫХ СЕНСОРОВ НА ОСНОВЕ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ПЛАНАРНЫХ ЭЛЕКТРОДОВ.
3.1. Холинэстеразные сенсоры на основе печатных электродов, модифицированных нафионом .
3.2. Холииэстеразный сенсор на основе печатных электродов, модифицированных берлинской лазурью
3.2.1 Влияние условий иммобилизации на характеристики сенсора
3.2.2. Определение пестицидов с помощью АХЭБЛ сенсора
4. ПЕРОКСИДАЗНЫЕ СЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ПЛАНАРНЫХ ЭЛЕКТРОДОВ
4.1. Определение органических субстратов ПХ.
4.1.1. Иммобилизация ПХ на немодифицированных электродах и выбор рабочих условий измерения сигнала биосснсора
4.1.2. Определение фенолов и ароматических аминов.
4.2. Биферментные сенсоры на основе толстопленочных угольных электродов, модифицированных политираиином
4.2.1. Определение субстратов ПХ и БуХЭ.
4.3. Определение промазина и хлоропромазина при помощи модифицированного полианилином электрода и пероксидазного сенсора.
4.4. Иммуносенсоры с индикаторной пероксидазной реакцией
4.4.1. Определение цефтазидима
4.4.2 Определение нонилфенола.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ БИБЛИОГРАФИЧЕСКИХ ИСТОЧНИКОВ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
АХЭ ацетилхолинэстераза ,
АТХХ ацетилтиохояин хлорид АТХИ ацстилтиохолин иодид БСА бычий сывороточный альбумин БуТХИ бутирилтиохолин иодид БуХЭ бутирилхолинэстераза БЛ берлинская лазурь Х пероксидаза из хрена ХЭ холинэстсраза I степень ингибирования,
I катодный или анодный ток, мкА Кщ константа Михаэлиса, М
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Сам носитель при этом может находиться в компактной форме на инертном носителе пленочные или твердые пористые материалы, диспергироваться в виде порошка в водной среде или размещаться в реакторах колонках различного типа. В качестве инертных наполнителей ношпелей фермента применяют силикагель или полисахариды производные целлюлозы, крахмал, декстраны. При создании ферментных сенсоров предпочтение отдастся т. Последний играет при этом роль механической опоры. В этом случае удается минимизировать толщину поверхностного белкового слоя и ускорить процессы массопереноса реагирующих веществ из раствора к месту локализации фермента. Кроме того, при использовании тонких поверхностных слоев белка облегчаются задачи масштабирования эксперимента, например, при серийном производстве бносенсоров или автоматизации изготовления. Современный этап создания биоссисоров характеризуется использованием все более сложных матриц для иммобилизации фермента. Происходит объединение различных подходов к закреплению биополимеров ковалентной сшивки, включения в полимерные трехмерные матрицы, физической сорбции. Другая тенденция упрощение самой процедуры иммобилизации. Возвращение к приемам физической сорбции и появление новых способов включения фермента в пленку полимера, например, в процессе его электрополимеризацин основные тенденции совершенствования способов иммобилизации ферментов для создания биосснсоров. Не существует идеального способа иммобилизации, применяемого для всех ферментов. Так, адсорбция дает хорошие результаты при использовании биосснсоров в неводных средах, но часто не обеспечивает воспроизводимости сигнала в водной среде изза частичного смыва фермента с поверхности преобразователя. Ковалентное связывание при помощи бифункциональных реагентов, таких, как глутаровын альдегид, стабилизирует активность иммобилизованного фермента, но ведет к повышенному расходу препарата изза его побочной инактивации. Тем не менее, кросссшивка глутаровым альдегидом в силу доступности реагента и его дешевизны остается наиболее широко применяемым способом иммобилизации ферментов при создании биосенсоров, в том числе, на основе печатных электродов из углеродных материалов. К методам нековалентной иммобилизации можно отнести адсорбцию, включение в состав полимерных мембран и поверхностных пленок, аффинную иммобилизацию. В случае адсорбции на электроде спонтанная денатурация белка минимальна, хотя расход препарата фермента достаточно велик. Фермент удерживается на поверхности носителя за счет электростатических, Вандерваальсовых, ионных и водородных взаимодействий, которые достаточно слабы, но множественны и обеспечивают относительно прочное связывание. Особое внимание уделяют свойствам поверхностей, на которых закрепляют фермент и их модификации для улучшения связывания. IX и се субстратную специфичность. Иммобилизация фермента в растущую пленку полимера, формируемую в процессе электролиза простая и быстрая процедура, которая позволяет контролировать толщину биочувствитсльного слоя и легко поддастся автоматизации при массовом производстве. Элсктрополимсризация ароматических аминов и спиртов, чаще всего используемых в этих целях, требует присутствия сильных кислот. Это приводит к денату рации большей части фермента в процессе его иммобилизации в расту щем слое полимера 1. Другим способом мягкой иммобилизации фермента является физическое включение биологического материала в полимерну ю матрицу. Полимер может осаждаться из ор1анического растворителя при его разбавлении водой или из микроэмульсии при высушивании. Отсутствис ковалентных связей с носителем и благоприятное гидрофильное микроокружение фермента помогают сохранить его активность, особенно при последующем использовании иммобилизованных препаратов в водноорганических и преимущественно органических средах гексан, тетраги дрофу ран, насыщенные буферными растворами. Своеобразным включением в нерастворимую матрицу можно считать внесение фермента в материал электрода обычно графитовые насты, часто в сочетании с последующей кросссшивкой глутаровым альдегидом или покрытием тонкими полимерными мембранами, препятствующими вымыванию белка.