Электрохимические ДНК-сенсоры на основе электрополимеризованных материалов

• Автор: Порфирьева, Анна Вениаминовна
• Шифр специальности: 02.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Казань
• Количество страниц: 167 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЕ ДИКСЕНСОРЫ Литературный обзор

1.1. Особенности строения нуклеиновых кислот, аптамеров и аутоиммун

ных антител к ДНК как элементов биосенсоров

1.1.1. Особенности строения нуклеиновых кислот

1.1.2. Аптамеры.

1.1.3. Аутоиммунные антитела к ДНК

1.2. Электрохимические ДНКсенсоры

1.2.1. Общая характеристика электрохимических ДНКсенсоров

1.2.2. Способы электрохимической регистрации ДНК и взаимодействий ДНК с низкомолекулярными соединениями.
1.2.2.1 Прямая электрохимия ДНК.
1.2.2.2. Регистрация сигнала ДНК с помощью электрохимически
активных меток и маркеров.
1.2.3. Определение антител к ДК.
1.3. Применение электрополимеризованных материалов в ДНКсенсорах
1.3.1. Получение и свойства полианилина.
1.3.2. Полипиррол в составе ДНКсенсоров
1.3.3. Полифенотиазины в составе электрохимических сенсоров.
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
2.1. Материалы и реагенты.
2.2. Приборы и оборудование.
2.3. Методы исследования
2.3.1. Получение биочувствительного слоя бносеисоров
2.3.1.1. Электроиолимеризация.
2.3.1.2. Иммобилизация ДНК, аитамероп и олигомеров
2.3.2. Измерение сигнала биосенсоров
3. ДНКСЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ ЗОЛОТЫХ ЭЛЕКТРОДОВ, МОДИФИЦИРОВАННЫХ СОПОЛИМЕРОМ ТИРАМИНА И яАМИНОФЕНОЛА .
3.1. Электрохимическое поведение М3 на золотых электродах.
3.2. Использование в качестве матрицы сополимеров тирамина и оаминофенола
4. АПТАСЕНСОРЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТРОМБИНА НА ОСНОВЕ ЭЛЕКТРОПОЛИМЕРИЗОВАННЫХ МАТЕРИАЛОВ .
4.1. Аптасенсоры на основе полимерных форм фенотиазиповых красителей
4.1.1. Определение тромбина методом пьезокварцевого
микро взвешивания
4.1.2. Потенциометрические апгасенсоры на тромбин
4.2. Аптасенсор на основе полианилина.
4.2.1. Потенциометрический аптасенсор на основе полианилина.
4.2.2. Импедимстрические измерения
5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АУТОИММУННЫХ АНТИТЕЛ К ДНК.
5.1. ДНКсенсор на основе полианизина.
5.1.1. Потенциометрические измерения
5.1.2. Импедиметрические измерения
5.2. ДНКсенсоры на основе электродов, модифицированных
полифено тиазинами.
5.2.1. Потенциометрические ДНКсенсоры
5.2.2. Импедиметрические измерения
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ БИБЛИОГРАФИЧЕСКИХ ИСТОЧНИКОВ.
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
М3 метиленовый зеленый
МС метиленовый синий
ПАНИ полианилин
полиМЗ полимерная форма метиленового зеленого полиМС полимерная форма метиленового синего
РНК рибонуклеиновая кислота
С концентрация, нМ, мкМ и мМ
Сит предел обнаружения, М или мгл
СРЕ постояннофазовый элемент
Е потенциал или сигнал ДНКсенсора, мВ
, сопротивление переноса заряда i катодный или анодный ток, мкА.
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


В работе использовали оборудование Федерального центра коллективного пользования уникальным научным оборудованием Казанского государственного университета. Автор выражает благодарность проф. Т.Хианику Университет Комениуса, Словакия за сотрудничество в области создания биосенсоров на атромбин, проф. Л.И. Анчиковой, доц. Г.Р. Вагаповой и асп. Е.Ю. Подшивалиной кафедра эндокринологии Казанской государственной медицинской академии, предоставившим сыворотки крови больных аутоиммунными заболеваниями и участвовавшим в обсуждении результатов их тестирования с помощью потенциометрических ДНКсенсоров, зам . ЗАО Литех г. Москва к. И.А. Волкову, предоставившему для исследований ДНКзонды для создания ДНКсенсоров для регистрации гибридизационных взаимодействий. Нуклеиновые кислоты и, прежде всего, дезоксирибонуклеиновые кислоты ДНК являются одними из наиболее перспективных элементов распознавания в составе различных биосенсорных устройств 1,2. Значительное внимание, уделяемое ДНКсенсорам, обусловлено как особенностями строения рецепторов, так и актуальностью решаемых с их помощью задач. Нуклеиновые кислоты представляют собой биополимеры, состоящие из гетероциклических оснований, связанных рибозофосфатными мостиками 3. В составе биосенсоров используют как нативную ДНК, так и се фрагменты, дезоксирибонуклсотиды, далее называемые олигонуклеотидами. Помимо этого, в составе ДНКсенсоров в последнее время активно применяют синтетические олигонуклеотиды, обладающие высоким сродством к биологическим мишеням. Их называют ап гамерами 4. Аптамеры могут быть как производными ДНК, так и рибонуклеиновых кислот РНК и в отличие от олигонуклеотидов не имеют прямых аналогов среди фрагментов природных нуклеиновых кислот. К числу гетероциклических оснований в составе нуклеиновых кислот относят урацил, тимин Т, аденин А, гуанин Г и цитозин Ц. Взаимодействие этих нуклеиновых оснований приводит к связыванию посредством водородных связей остатков цитозина и гуанина, аденина и тимина с образованием так называемых комплементарных пар оснований 3. В функциональном смысле две цепи ДНК не эквивалентны. Кодирующая матричная цепь считывается в процессе транскрипции. Некодирующая антисмысловая цепь подобна РНК при условии замены остатков урацила на тимин. Рисунок 1. Сравнение В, А и 2форм ДНК. Вформа, Ь Аформа, с Ъ форма 5. Разрушить спаривание отдельных нитей нативной ДНК можно, лишь разорвав многочисленные водородные связи, объединяющие цепи. Так происходит, например, при нагреве ДНК или при добавлении кислот или щелочей для ионизации нуклеиновых оснований. Раскручивание двойной спирали ДНК называют плавлением, так как оно происходит в строго определенном интервале температур. Молекулярная структура ДИК стабилизируется молекулами воды и ионами металлов и может меняться при варьировании различных факторов при повышении температуры, смене растворителя, ионного состава среды, ее кислотности и т. В клетке двунитевые ДНК образуют в основном Вспираль спираль УотсонаКрика. В центре се располагаются комплементарные пары нуклеиновых оснований, а снаружи остатки фосфорной кислоты и сахаров. Внутренняя область ДНК, где локализованы нуклеиновые основания, неполярна. Внешняя часть двойной спирали заряжена отрицательно за счет углеводных остатков и фосфатного остова. Цепи ДНК на протяжении всего тяжа образуют два желобка, называемые большой и малой бороздками. Большая бороздка место связывания белков, ассоциированных с ДНК. Ароматические кольца нуклеиновых оснований в Вспирали почти перпендикулярны ее оси, каждое основание повернуто относительно предыдущего на . Спираль состоит из антипараллельных дезоксирибонуклеиновых цепей, закрученных вправо. На каждый виток спирали приходится примерно пар оснований, ход спирали 3. Прочность связывания обусловлена многочисленными водородными связями каждая пара АТ образует два, пара ГЦ три линейных, и потому особо прочных мостика. Урацил, содержащийся в РНК, ведет себя подобно тимину. Помимо Вструктуры ДНК, известна Аструктура. Она представляет собой правую спираль с иным углом наклона нуклеиновых оснований и обнаруживается для некоторых синтетических ДНК и природных ДНК при их дегидратации 5.