Моделирование болезни Гентингтона с помощью индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека

• Автор: Некрасов, Евгений Дмитриевич
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 93 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1Л. Репрограммирование ядра соматической клетки
1.2. Генетическое репрограммирование соматических клеток до
плюрипотентного состояния
1.3. Возможности дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в нейроны..
1.4. Использование генетического репрограммирования для изучения и лечения нейродегенеративных заболеваний
1.5. Болезнь Альцгеймера
1.6. Шизофрения
1.7. Боковой амиотрофический склероз
1.8. Болезнь Паркинсона
1.9. Болезнь Гентингтона
1.10. Перспективы моделирования болезни Гентингтона с помощью ИПСК
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Клеточный материал
2.2. Культивирование фибробластов
2.3. Получение культуры фибробластов из биоптатов кожи человека
2.4. Замораживание и оттаивание клеток
2.5. Культивирование ЭСК и ИПСК человека в бесфидерных условиях
2.6. Культивирование ЭСК и ИПСК человека на фидере
2.7. Приготовление фидера
2.8. Покрытие желатином культуральной посуды
2.9. Сборка лентивирусов
2.10. Инфекция клеток лентивирусными векторами
2.11. Определение титра лентивирусов
2.12. Получение ИПСК
2.13. Окраска антителами клеточных культур
2.14. Агарозный гель-электрофорез нуклеиновых кислот
2.15. Выделение хромосомной ДНК
2.16. Выделение плазмидной ДНК
2.17. Выделение тотальной РНК из клеточных культур
2.18. Реакция обратной транскрипции

2.19. Полимеразная цепная реакция
2.20. Приготовление препаратов метафазных хромосом ЭСК и ИПСК человека
2.21. вТО-дифференциальное окрашивание
2.22. Формирование эмбриоидных телец
2.23. Культивирование эмбриоидных телец
2.24. Спонтанная дифференцировка ЭСК и ИПСК
2.25. Тест на формирование тератом
2.26. Дифференцировка ПСК человека в серединные шипиковые нейроны стриатума
2.27. Культивирование нейрональных предшественников
2.28. Электронная микроскопия
2.29. Рига-2 кальциевый имэджинг
2.30. Электрофизиологические исследования
2.31. Проточная цитометрия клеток, окрашенных ЬузоЦаскег
2.32. Химические вещества для количественных экспериментов
2.33. Количественный анализ формы клеточных ядер
2.34. Количественный анализ гибели клеток
2.35. ВЭЖХ анализ секреции ГАМК
2.36. Клонирование фрагментов ДНК в плазмидный вектор
2.37. Секвенирование фрагментов ДНК по Сэнгеру
2.38. Полнотранскриптомный анализ экспрессии генов
2.39. Статистический анализ
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Оптимизация генетического репрограммирования соматических клеток человека
3.2. Получение фибробластов кожи от пациентов с хореей Гентингтона с малым количеством избыточных повторов в мутантном аллеле гена хантингтина
3.3. Проведение генетического репрограммирования фибробластов кожи
пациентов с болезнью Гентингтона
3.4. Молекулярная характеристика ИПСК
3.5. Функциональная характеристика ИПСК
3.6. Характеристика набора клеточных линий для моделирования болезни Гентингтона
3.7. Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток человека в клетки, имеющие характеристики серединных шипиковых нейронов стриатума

3.8. Проявления болезни Гентингтона в мутантных серединных шипиковых нейронах стриатума, дифференцированных из ИПСК человека in vitro
3.9. Количественный анализ содержания лизосом в нормальных и
патологических нейронах
3.10. Количественный анализ деформации ядерной оболочки внутрь клеточного ядра (инвагинация) в нейронах, полученных из ИПСК пациентов с болезнью Гентингтона и контрольной группы
3.11. Исследование природы инвагинаций ядерной оболочки
3.12. Транскриптомный анализ дифференцированных in vitro нейронов человека, полученных из ИПСК пациентов с болезнью Гентингтона и контрольных ПСК
3.13. Депо-управляемый вход кальция в нормальных и патологических нейронах
3.14. Изучение действия потенциального лекарства от болезни Гентингтона EVP4593 на фенотипические проявления болезни в нейронах,
дифференцированных из ИПСК
3.15. Моделирование старения нейронов
3.16. Изучение действия потенциальных лекарств от болезни Гентингтона на
модели стареющих нейронов
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

содержал (в мМ) 140 NMDG-Asp, 10 ВаСЬ, 30 HEPES-Cs, 0.01 нифедипин и 0.001 тетродотоксин, pH 7.3. Депо-управляемые токи вызывали применением 1 мкМ тапсигаргина (Tocris Bioscience, Великобритания) во внешнем растворе.
2.31. Проточная цитометрия клеток, окрашенных Lysotracker
Клетки культивировали в 48-луночном планшете в культуральной среде К-4. Клетки отделяли от культуральной посуды с помощью TrypLE Express (Life Technologies, США), суспендировали с помощью пипетирования, TrypLE Express инактивировали с помощью среды (DMEM/F12, пенициллин-стрептомицин, L-глутамин, FBS 10%), после чего считали количество клеток с помощью клеточного счетчика Countess® Automated Cell Counter (Invitrogen, США). Клетки центрифугировали при 400 g, надосадочную жидкость сливали и ресуспендировали клетки в среде (DMEM/F12, пенициллин-стрептомицин, L-глутамин) до концентрации 2000000 клеток/мл. Клетки инкубировали в течение 5 минут при 37°С, LysoTracker® Green DND-26 (Invitrogen, США) добавляли до конечной концентрации 75 нМ и инкубировали в течение 30 минут при 37°С в темноте. Клетки центрифугировали при 400 g, надосадочную жидкость сливали и ресуспендировали клетки в охлажденном льдом растворе (PBS -Mg -Са, 0.1% BSA). Клеткам добавляли антитела к CD56 (в разведении 1:25) или изотопический контроль Mouse IgGl (в разведении 1:166), в течение 40 минут на льду, центрифугировали при 400 g, надосадочную жидкость сливали и клетки ресуспендировали в охлажденном льдом PBS (PBS -Mg -Са, 0.1% BSA), центрифугировали при 400 g, надосадочную жидкость сливали и клетки ресуспендировали в охлажденном льдом растворе (PBS -Mg -Са,
0.1% BSA) до концентрации 2000000 клеток/мл и подвергали флуоресцентно-активированный сортировке клеток с помощью проточного цитометра Gallios (Beckman Coulter, США).
2.32. Химические вещества для количественных экспериментов
В работе были использованы следующие химические вещества в обозначенных конечных концентрациях: 4-8 мМ LiCl (Sigma-Aldrich, США), 5-10 мкМ MG132 (Abeam, США), 12.5-25 мкМ LY294002 (Tocris Bioscience, Великобритания), 250-1000 нМ Thapsigargin (Tocris Bioscience, Великобритания), 30-3000 нМ EVP4593 (Sigma-Aldrich, США), 100 мкМ DTT (Life Technologies, США), 25-50 мкМ Dimebon (Sigma-Aldrich, США), 50 мкМ 2-АРВ (Sigma-Aldrich, США), 2 мкМ Ruthenium Red (Tocris Bioscience, Великобритания).