Покоящиеся формы неспорообразующих бактерий : свойства, разнообразие, диагностика

• Автор: Мулюкин, Андрей Львович
• Шифр специальности: 03.02.03
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 349 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Явление покоя у бактерий

1.1. Основные термины и положения

1.2. Стационарные (пролиферативно покоящиеся) клетки

1.3. Специализированные покоящиеся формы бактерий

1.3.1. Типы специализированных покоящихся форм

1.3.2. Генетические механизмы контроля образования покоящихся форм

1.3.3. Свойства специализированных покоящихся форм

1.3.4 Механизмы устойчивости и прорастания покоящихся форм (на примере
эндоспор)
1.3.5. Диагностика покоящихся форм
Глава 2. Состояние покоя у неспорообразующих бактерий
2.1. Некультивируемые клетки '
2.1.1. Ультрамикробактерии
2.1.2. Жизнеспособные некультивируемые клетки
2.1.3. Восстановление способности некультивируемых клеток ревертировать к
росту'
2.2. Недостаточно изученные способы выживания неспорообразующих бактерий
2.3. Цистоподобные формы
Глава 3 . Ауторегуляция процессов образования покоящихся форм
3.1. Ауторегуляция процессов образования спор и акине г
3.2. Ауторегуляция цитодифференцировки и синтеза вторичных метаболитов стрепто-мицетов
3.3. Ауторегуляторы развития миксобактерий
3.4. Кворум-сснсинговая регуляция стационарной фазы
3.5. Ауторегуляторные факторы и сЬ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 4. Объекты и методы исследования
4.1. Объекты
4.2. Базовые среды и условия культивирования микроорганизмов
4.3. Микробиологические методы
4.4. Стрессорные воздействия и устойчивость клеток
4.5. Приемы реанимации покоящихся клеток
4.6. Исследование фенотипической диссоциации
4.7. Микроскопические методы
4.8. Биохимические методы 91.
4.8.1. Включение радиоактивно-меченых предшественников белков и нуклеино- 91 вых кислот
4.8.2. Выделение, очистка и идентификация ауторегуляторных факторов <ф
4.8.3. Выделение надмолекулярных комплексов ДНК (НК ДНК)
4.8.4. Выделение клеточных липидов и определение их содержания
4.8.5. Анализ метиловых эфиров жирных кислот (МЭЖК)
4.8.6. Определение активности ферментов
4.9. Молекулярно-генетические методы

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Глава 5. Свойства цистоподобных покоящихся форм
5.1. Особенности морфологии и ультраструктурной организации
5.2. Длительность сохранения колониеобразующей способности
5.3. Экспериментально не выявляемая метаболическая (дыхательная) активность
5.4. Устойчивость к повреждающим воздействиям
5.5. Доказательства образования ЦГПС как этапа в цикле развития культур 132 Глава 6. Условия образования цистоподобных покоящихся клеток
неснорообразующих бактерий
6.1. Трофическая регуляция образования ЦГТК
6.2. Плотностная регуляция образования ЦПК
6.3. Развитие стресса голодания
6.4. Внесение химического аналога аутоиндукторов анабиоза
Глава 7. Разнообразие покоящихся форм неспорообразующнх бактерий
7.1. Внутривидовое разнообразие покоящихся форм неспорообразующнх бактерий
7.1.1. Разнообразие ЦПК P. awantiaca и P.fluorescens
7.1.2. Внутривидовое разнообразие покоящихся форм М. smegmatis 154.
7.2. Межштаммовый уровень разнообразия покоящихся форм
7.3. Внутрипопуляционное разнообразие покоящихся форм
7.3.1. Внутрипопуляционное разнообразие ЦПКМ luteus
7.3.2. Внутрипопуляционный уровень разнообразия покоящихся форм у
М. smegmatis
7.3.3. Внутрипопуляционное разнообразие покоящихся форм бактерий (ЦПК и эндоспор) по показателям термоустойчивости и реверсии к росту
Глава 8. Фенотипическая вариабельность: сопряженность с состоянием
покоя и свойства днссоциантов
8.1. Фенотипическая диссоциация у P. aurantiaca и P. fluorescens
8.2. Фенотипическая вариабельность у штаммов Sp7 и sp245 A. brasilense
8.3. Фенотипическая диссоциация с выщеплением антибиотикоустойчивых вариантов
8.4. Изучение фенотипической диссоциации с выщеплением вариантов, различающихся по показателям устойчивости и способности к образованию покоящихся форм как механизма переживания бактерий в окружающей среде
Глава 9. Диагностика и более полное выявление покоящихся форм
9.1. Изучение покоящихся клеток в природных субстратах in situ прямыми микроскопическими методами ’
9.2. Разработка специальных процедур и применение различных методов учета для выявления пролиферативно-активных покоящихся клеток, не обнаруживаемых методами посевов
9.3. Повышение чувствительности ПЦР для детекции покоящихся форм как источника ДНК-матриц
Глава 10. Ауторегуляция процессов перехода бактерий
в покоящееся состояние
10.1. Выделение и изучение природы ауторегуляторных факторов Ф
10.2. Динамика накопления ауторегуляторного фактора ф Micrococcus luteus
10.3. Биологические эффекты АОБ
10.3.1. Биологическая активность ауторегуляторных факторов
10.3.2. Зависимость эффектов АОБ от возраста культур
10.3.3. Зависимость эффектов АОБ от их концентрации
10.3.4. Универсальность и особенности ауторегуляции, осуществляющейся при участии факторов ф (АОБ)
10.3.5. Функции АОБ в образовании нежизнеспособных мумифицированных кле- 249 ток
10.4. Механизмы действия АОБ в процессах приобретения и поддержания состояния покоя
10.4.1. Роль АОБ в ингибировании метаболических процессов у покоящихся форм и их устойчивости
10.4.2. Роль АОБ в изменении структурной организации ДНК
10.4.3. Функции АОБ при прорастании покоящихся форм
10.5. Сравнительное изучение действия низкомолекулярных ауторегуляторов - неаци-лированного лактона гомосерина и алкилоксибензола - на рост и развитие бактерий
Прикладные аспекты исследований
ОБСУЖДЕНИЕ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ эн
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

2002; 2003; Hilbert, Piggot, 2004]. Споруляция у В. subtilis контролируется факторами транскрипции, действие которых скоординировано во времени и реализуется в различных компар-тментах [Stragier, Losick 1996; Piggot, Losick 2002]. Начальная стадия спорообразования находится под контролем SpoOA - белка, который является главным регулятором на начальных этапах спорообразования [Hoch, 1993; 2000; Molle et al., 2003]. Белок SpoOA активен в фосфо-рилированной форме, а его фосфорилирование опосредуется при участии специфической сенсорной системы с участием киназ и двух белков SpoOF и SpoOB [Burbulys et al., 1991].Действие фосфорилированного Spo0A~P вместе с РНК-полимеразой, содержащей в качестве субъединицы «вегетативный» сгА-фактор или альтернативный /-фактор, обуславливает транскрипцию генов, необходимых на самых ранних стадиях спорообразования [Stragier, Losick 1996; Piggot, Losick 2002]. Если принять во внимание, что эти сигма-факторы регулируют экспрессию генов на начальной стадии роста (/) и фазы замедления роста (/), когда достигается высокая плотность клеток, то Spo0A~P задействует «вегетативный транскрипционный • аппарат» для подготовки клетки к спорообразованию. Гены, транскрипция которых регулируется Spo0A~P, необходимы для расположения хромосом вдоль длинной оси спору-лирующей клетки [Pogliano et ai., 2002; Ben-Yehuda'et al., 2003 а, б] и образования асимметричной септы, отделяющую будущую проспору [Levin, Losick 1996; Ben-Yehuda, Losick 2002]. Spo0A~P также регулирует экспрессию генов, продуктами которых, в том числе, являются аЕ и (/'факторы, специфичные для материнской клетки и проспоры [Stragier, Losick, 1996; Piggot, Losick 2002].
Представления о регуляторной роли SpoOA существенно расширены. Показано, что он играет также роль регулятора транскрипции генов в материнской клетке после асимметричной ссптации [Fujita, Losick, 2003]. Было также выявлено еще 103 гена, положительно или отрицательно регулируемых SpoOA [Molle et al., 2003]. На дальнейших стадиях спорообразования экспрессия.генов находится под контролем четырех с/, /, о° и ок-факторов. Если сЕ и с/ осуществляют контроль генной экспрессии после образования асимметричной септы, то два других - / и / - в материнской клетке и проспоре - на более поздних этапах развития, после поглощения проспоры материнской клеткой [Оке, Losick, 1993; Errington, 1993; Stragier, Losick, 1996; Hilbert, Piggot, 2004 и ссылки]. В вегетативных клетках последовательность ДНК, кодирующая синтез (/-фактора, не считывается за счет инсерции большого участка хромосомы (42’.000 оснований) [Kunkel et al, 1990]. После асимметричной септации и только в материнской клетке происходит внутригеномная сайт-специфичная рекомбинационная перестройка ДНК с удалением инсерции, что дает возможность экспрессии гена (/-фактора [Оке, Losick, 1993]. Следующий уровень регуляции /-фактора - его процессинг, который проходит при отщеплении терминального участка ИНг-конца (20 аминокислот). За процессинг /-фактора отвечает протсаза, экспрессирующаяся на определенной стадии споруляции в материнской клетке и активизирующаяся, когда получает сигнал из проспоры. Полагают,